描述蛋白质组学的进展
在此综述期间之开始,基本上所有的蛋白质组计划都是建立在分离蛋白质、 成像和定量的2DE和蛋白质鉴定的质谱联用的基础上。此方法通过上述的MS发展、2DE的进步和创新性的凝胶电泳和MS联用的推动下前进。2DE的前进包括引入新的荧光染色方法,与银染方法相比可以提供更高的敏感度、更大动态范围[15]和通过扩展第一向的pI范围与在2DE之前预分复杂的蛋白质复合物增强分辨率(综述参见[16])。Binz等[17]描述了一个新的方法来系统分离2DE分离的蛋白质。所有在2D凝胶中的蛋白质转移印迹到一个共价衍生有胰蛋白酶的膜上进行同步消化。生成的肽随之捕获在膜上,然后通过MALDI-TOF质谱指纹分析识别。总的2DE-MS方法已经被用来生成来自不同物种的无数细胞类型的注解的2D凝胶数据库。部分这些资源的列表可以通过因特网获得。(www.lecb.ncifcrf.gov/EP/table2Ddatabases.html)。
尽管这些进展推进了2DE为基础的蛋白质组技术,它们没有强调此方法检测具体类别蛋白质的根本限制,包括低丰度、差溶解度极大或极小体积以及极端的pI值。一些研究组因此探索在蛋白质组计划中替代一个或同时两个凝胶电泳象限。Loo等[18]直接用MALDI-TOF质谱仪扫描IEF凝胶替代2DE的SDS-SAGE象限,这样产生了一个"虚拟2D凝胶"成像,在其中蛋白质质量是用质谱测量的。Oda等[19]用制备用的反相(RP)-HPLC替代2DE的IEF相,Wall等[20]在溶液中应用制备用的IEF,随后用无孔的树脂在MALDI-TOF-MS之前进行HPLC分离蛋白质。Link等[21]完全摈弃了任何蛋白质分离。它们通过消化未分离的蛋白质样品并用二维(强离子交换/RP)层析(LC/LC)耦联到一个ESI-MS/MS设备上分析产生的肽混合物来分析复杂的蛋白质混合物。使用一个类似的LC/LC-MS/MS,我们成功地检测到低丰度酵母蛋白质,并因此证明此方法能够克服2D凝胶的局限性的动态范围[22]。
这些进展的目标是蛋白质组分析技术的更高的通量、更强的自动化和增强的综合性。可以预计这些进展将会持续,而且可能为显微制造技术应用所加速。它的早期范例包括制造样品处理设备[23,24]和表面增强的激光解吸/电离(SELDI)蛋白质芯片来分离和分析具有特定特征的蛋白质和肽[25]。尽管这些方法可能最终在一个样品中检测和识别每一个蛋白质,但是2DE是个例外,因为它本身不是定量的。
定量蛋白质组学
在非2DE为基础的蛋白质分析中加入一个定量的元素,可行的技术-稳定的同位素标记[26]已经被应用到蛋白质分析中。此方法涉及将化学组成相同但稳定同位素标记的内标准(如使用2H、13C、15N等)掺到样品中。因为电离效率对于不同肽是高度多变的,对于一个肽的唯一适合的内标准是标记有稳定同位素的同一个肽。定量蛋白质分布图因此用含有相同蛋白质但不同丰度、并标记有重稳定同位素的第二个样品与一个蛋白质混合物(参考样品)进行比较而完成。在理论上,分析对标本中所有的肽具有相同的序列但是不同的质量。因为肽对具有相同的物理化学特性,它们被认为在提取、分离和电离中具有相同的表现。因此,低和高质量组成的强度的比率提供了精确测定在原始蛋白质混合物中肽的相对丰度(因而得到蛋白质的)。三个研究组基于稳定同位素技术已经独立报告测量蛋白质分布图[8,19,27],另外两个研究组正在写它的手稿(H Langen等,个人通讯;P James等,个人通讯)。在方法中,掺入的同位素以及使用的分析步骤中这些技术存在差别。
Oda等[19]在含有自然丰度的同位素氮(14N,99.6%;15N,0.4%)的培养基中生长酵母培养物,而另外一个培养物在同样富集15N(>96%)的培养基中生长。在合适的生长期过后,收集细胞,通过RP-HPLC以及随后的SDS-PAGE提取和分离兴趣蛋白质。胶内消化切除的兴趣点导致肽段生成,然后用肽质量图谱鉴定。研究者测定了两个酿酒酵母生成的42个高丰度蛋白质,发现它们只在表达G1期细胞周期素CLN2的能力上有差异。此实验技术的差错百分比发现是优异的(±10%)。研究者们用同一技术继续研究在酵母蛋白-Ste20中的差异磷酸化状态。Pasa-Tolic等[8]利用稳定同位素耗竭的培养基传递一个特异的同位素信号到蛋白质中。它们比较在正常和少见的同位素耗竭(13C、15N和2H"耗竭")培养基中生长的E.Coli对钙压力反应。通过FT-ICR-MS进行了完整的蛋白质质量测定。尽管没有检测到蛋白质,200个不同蛋白质的表达比率进行了比较。
很明显,用15N富集或耗竭的培养基的稳定同位素代谢蛋白质标记与2DE或其它分离技术结合允许定量的蛋白质分布图。然而,此技术有一些缺点。首先,此技术不允许直接从组织中分析蛋白质。第二,稳定同位素富集的培养基昂贵,并可能它们本身影响到细胞生长和蛋白质生成。第三,因为同位素掺入导致质量的微小增加直到序列确定后才知道。因此,蛋白质鉴定必须在定量之前进行。