7. 仪器设备
7.1 冷冻离心机(Jouan CR422)
7.2 40mL特氟隆离心管
7.3 超声波(L&R 140S)
7.4 2mL玻璃瓶及盖
7.5 0.3mL HPLC瓶及盖
7.6 全玻璃过滤器(滤纸直径47mm)(Millipore UK Ltd)
7.7 Virtis匀浆器(Virtis Model 45)
7.8 50mLVirtis玻璃管
7.9 分析天平
7.10 天平准确度0.1g
7.11 涡漩混匀器
7.12 磁力搅拌器
7.13 绞肉机
7.14 50,100,250,1000mL容量瓶
7.15 4℃冰箱
7.16 0.2,0.5,1.0mL吉尔森移液器(Gilson Pipetman)
7.17 pH计
7.18 巴斯德吸管
7.19 巴斯德吸管胶皮球
7.20 0.2 m尼龙滤膜
7.21 高效
液相色谱仪—泵:附脉冲膜阻止器Spectroflow 400二元泵(Foster City,USA)
—进样器:自动进样器(Model 507 Beckmann)配100 l进样管
—检测器:Shimadzu RF-551荧光检测器,配150W短弧氙灯,激发波长340nm,发射波长440nm,设灵敏度为“high”档,增益为“1”
—柱:125mm×4mm i.d. Lichrospher 100 RP-18,5 m,柱两头加塞置45℃恒温箱中保存,
柱子每周运行一个溶剂梯度再生 起始甲醇/H2O(6.3.10)15min内至100%甲醇并保持15min,冲洗流速1.2mL/min,进样300次后换新柱;
—使用与HPLC泵相似的泵和一个死体积小的三通管(Model 5-8283; Supelco, St. Germain-en-laye, France)添加OPA溶液(6.3.9)完成柱后衍生化反应;
—衍生化反应在特氟隆管状反应器(3m×0.5mm i. d.)(Model 5-9206, Supelco)中进行,反应器温度45℃,OPA流速为0.5mL/min;
—流动相流速1.2mL/min;
—保护柱:4mm×4mm i. d.(进样100次后更换)。
8. 样品和取样程序
有关要求引自ISO文件78/2-1982 6.3.1节及2052/VI/84-EN附录Ⅱ。
8.1 样品的性状,样品应符合64/433/EEC指令中测定肉中药物残留的要求;
8.2 样品量,样品量应满足测定方法及复验所需量的要求;
8.3 样品保存和包装应达到在实验室中能正确辨识的要求;
8.4 样品的包装、保存和运输方法应能满足样品保持原始性和完整性的要求,不能影响检测结果的判断,分析庆大霉素和新霉素的样品应在低于-18℃的条件下运输和贮存;
9. 测定步骤
9 .1 样品制备
样品应按批检验,控制样品应用添加方法检测限浓度的测定。
9.1.1 样品先进行解冻,然后绞碎。
9.1.2.1 称取5 0.1g绞碎样品置50mL Virtis管。
9.1.2.2 称取5 0.1g空白样品置50mL Virtis管。
9.1.3 添加500 l添加溶液(6.2.3或6.2.4(脂肪))置空白样品中(9.1.2.2),放置平衡30min。
9.1.4 加20mL TCA/EDTA溶液(6.3.4),用带U-形刀的匀浆器匀浆10min。
9.1.5 将匀浆物转移至特氟隆离心管(7.2)在5℃,8000rpm(7000g)条件下离心15min。
9.1.6 将上清液倾入一个50mL容量瓶中。
9.1.7 以30% NaOH调pH=7.0 0.1后,以pH7.0缓冲溶液(6.3.6)定容至50mL。
9.2 柱净化
9.2.1 柱制备
称取5g CM-Sephadex C-25交联葡萄糖(6.1.14)于Na2SO4/EDTA/叠氮化钠溶液(6.3.5)中浸泡过滤,在巴斯德吸管中塞入棉花(6.1.17)后,装添1mL浸泡后的交联葡萄糖,以Na2SO4/EDTA/叠氮化钠溶液(6.3.5)洗涤(2×1mL)备用。
9.2.2 取10mL萃取液(9.1.7)以每次1mL的速度注至柱中,以2×1mL Na2SO4/EDTA/叠氮化钠溶液(6.3.5),1mL H2O(6.1.10)和250 L 0.05mol L-1NaOH溶液依次过柱。
9.2.3 以1mL 0.05mol L-1NaOH 溶液洗脱庆大霉素和新霉素,并加压赶尽所有洗脱液。
9.2.4 加100 L 1mol/L HCl和100 L樟脑磺酸钠溶液(6.3.7)。
9.3 标准溶液省去匀浆和离心处理步骤,按同样方法处理。
9.4 HPLC
9.4.1 按7.22 HPLC设定条件,以自动进样器注入100 L样品溶液。
9.4.2 样品基体应在庆大霉素和新霉素出峰位置处无干扰。
9.4.3 检测器对庆大霉素和新霉素的线性关系可通过校正曲线确定。
9.4.4 庆大霉素(3个组份出一个峰)保留时间为4.0~4.1min,新霉素保留时间为5.3~5.4min。
10. 计算结果
样品中庆大霉素和新霉素浓度通过内插工作曲线法获得,工作曲线由添加样品峰面积对添加样品浓度制得。如果结果可疑,可对可疑阳性样品添加较大浓度标准溶液进行检测,如果重复检验结果在出峰位置只出一个大的峰,说明筛选检验结果确实是阳性的
10.2 (注意:阳性样品非常少,现推荐一个确证阳性样品的有效方法)
阳性样品定量应做平行样分析,工作曲线应覆盖阳性样品估值范围,工作曲线至少包括5个点(每个点重复测试3次)。工作曲线的覆盖范围应是从0至比可疑阳性样品估计浓度大10%。
10.3 优先使用确证的方法。使用该法以前必须对该法进行实验室内部重现性和重复性的确证。测定结果的不同浓度的样品添加分析应分三天内完成,回收率应在45~110%之间,批间样品和批内样品的变异系数应小于15%
牛组织中庆大霉素添加Nancy分析实验室的典型结果如下:
组 织 相关系数r 0.1 g/g添加 0.8 g/g添加 0.1 g/g添加 0.1 g/g添加
n =7 回收率(%) 回收率(%) SD(%) SD(%)
标准溶液 0.9999 100 100 3.2 2.2
肝 0.9986 98 70 11.8 5.6
肾 0.9974 68 83 12.7 8.2
脂 肪 0.9991 79 77 6.1 4.3
肌 肉 0.9989 88 74 9.9 8.2
10.4 0.5 g/mL庆大霉素和新霉素标准溶液HPLC测定峰参数如下:
庆大霉素 新 霉 素
保留时间(min) 4.0-4.1 5.3-5.4
分配因子(k') 2.2 3.3
理论塔板数/m 16225 9784
拖尾因子 1.2 1.4
选择性系数( ) 1.5 1.5
分离度(Rs) 2.1 2.1
11-15 略
16.检验流程图
组织样品→三氯乙酸萃取→离子交换色谱→HPLC→结果计算