主题：【第二届网络大赛参赛作品】···重磅出击，再谈“基质效应”··讨论升级，欢迎参与···

目录



1.基质效应的概念

2.基质效应的产生

3.基质效应的评价方法

4.基质效应的去除

5.FDA关于基质效应的规定

1.基质效应的概念

我们首先了解什么是基质（Matrix）。所谓基质，指标本中除分析物以外的一切组成。以测定血中红霉素的浓度为例，除了红霉素之外的蛋白、磷脂及其他内源性物质皆为基质。
基质效应，按美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）文件的定义为
①    标本中除分析物以外的其他成分对分析物测定值的影响；
②    基质对分析方法准确测定分析物的能力的干扰。广义说来，基质效应也应包括已知的干扰物（如红霉素测定中磷脂、血红蛋白、抗坏血酸等都是干扰物），但目前只将基质效应限于生物材料中未知或未定性的物质或因素（如粘度、pH等）的影响

2.基质效应的产生



本文主要针对使用液相色谱-质谱联用技术分析生物样品中的化合物所产生的基质效应进行讨论。而在生物样品（以血浆为例）中，引起基质效应的主要是磷脂、胆固醇等内源性物质。他们随同待测物从色谱柱上一起被洗脱出来，经离子源气化，进入质谱进行检测分析。而就在液滴气化、发生库伦爆炸变成小液滴直至产生气体离子的过程中，这些内源性的物质由于极性较大，会同待测物离子竞相竞争液滴表面，从而导致待测物的离子化效率降低或增强，引起响应降低或增高，这就产生所谓的基质抑制或基质增强效应。

3.基质效应的评价方法


目前在生物样品分析领域中，主要有两种方法对基质效应进行评价。一是柱后流动注射法(Post-column infusion method)。下图为例：



流动注射法是一定性方法，可以考察一个方法是否存在基质效应、是抑制还是增强，但不能对其进行定量分析。这种方法简单的讲就是在色谱柱后有一个流动注射泵，能够连续不断的、以恒定速度提供待测的分析物，这些分析物进入质谱就会产生基本稳定的响应；而含有空白基质的样品由液相色谱注入，经色谱柱的保留，从柱后流出，会同待测的分析物一同进入质谱，这时就会观察到待测物响应的是否变化、变化趋势如何，从而确定选择的样品处理方法是否合适。






另一种是样品处理后加入法（Post-extraction spike method）。下图所示：



与流动注射法相反的是，样品处理后加入法是可以对基质效应进行定量计算的方法。目前国内国际学者对其计算主要分为两种：绝对基质效应（Absolute matrix effect）和相对基质效应（Relative matrix effect）。前者是通过比较待测物在纯溶液中的响应与待测物加入空白生物样品经提取处理后的空白基质中的响应二者的比值来确定；而后者则是测定不同批次的生物基质来确定，Matuszewski提出至少要考察5个不同个体的基质样品来确定基质效应。

在上述方法中，有学者建议使用低、中、高三浓度的质量控制样品（QC）来评价基质效应的大小；有人建议使用定量下限（LLOQ）水平的6个个体的基质来评价；也有人建议使用不用批次的标准曲线的样品来评价，通过计算这几个批次各个浓度点的精密度（%RSD）来确定基质效应的大小。对于使用哪一种方法更为合理，目前没有定论。这也希望各位版友能够提供你们的做法和经验，看看哪种方法更为合理。

4.消除或降低基质效应的方法

【1】样品处理技术
总体来讲，基质效应是与生物样品处理不干净密切相关的。我们可以通过稀释处理后的溶液或者降低进样量，来降低基质效应对测定的影响，但这是治标不治本，背景噪音在降低的同时，待测物的响应也降低，对改善我们的测定灵敏度没有太大好处。其实，更为关键的是选择合适样品前处理方法。我们在生物分析中主要用到沉淀蛋白法（PPT）、液液提取法（LLE）和固相萃取法（SPE）。PPT适应于绝大多数化合物，对蛋白结合率的高低没有要求，操作步骤相对简捷，缺点就是处理后的样品不是很干净，内源性物质较多，从而产生较强的基质效应；LLE适于极性相对小、蛋白结合率低的化合物，提取步骤相对繁琐，但处理后的样品尤为洁净；而SPE根据填料的不同，适于分析的化合物的种类也有所差别，目前市面上有SPE小柱和SPE 96-well板，该方法特点是样品处理后干净，操作装置简单，绝大数的内源性物质被去除，使待测物浓缩，提高检测的灵敏度。

Sample Processing Instrument








我所进行的实验中，曾做过一个化合物A，质谱响应很低，浓度1µg/mL的纯溶液直接进样，SRM响应也就只有五六千，在这种情况下，处理样品时就首选固相萃取法，因为它能对样品进行浓缩，并能有效的降低基质效应的影响。而考虑到化合物Pka值呈弱碱性，所以选择Waters的MCX填料的萃取小柱。

当然，样品处理过程中各个洗脱容积的选择也是非常重要的。如果样品处理选择不当或者洗脱溶剂比例调节不好，那么方法的选择性就会很差，更为直观的表现出来就是不同个体的色谱图差异很大，如下图所示，




上图采用的洗脱溶剂是氨化甲醇，由3.5min左右的峰观察，内源性物质较多。同时，我们采用该方法，对基质效应进行了考察。方法为：选择6个不同来源的血浆样品，配制成LLOQ水平的样品，每个个体平行处理三份，然后进行分析。但结果显示，个体间的差异很大，并且已超出了规定的接受标准，这个也可以由上图直观的看出，因此我们对样品预处理方法进行了优化，并重新选择了洗脱溶剂。当采用新的处理方法后，依然对基质效应进行考察，6个不同来源的个体差异很小，见下图，并且选择性结果符合要求。

【2】色谱条件的优化
基质效应的产生，是由于内源性物质与待测物一同流出色谱柱，从而产生竞争抑制引起的。优化色谱条件，改变内源性物质与待测物在色谱柱上的保留时间，使其流出的速度不同，从而进入质谱的时间不同，这样就可以去除或降低基质效应的影响。比如待测物易离子化，那么调节样品或溶液中的ＰＨ值，会对它的保留、选择性和灵敏度产生很大的影响。
请看下面两图，色谱条件优化前




色谱条件优化后，




从优化后的色谱图中，可以看出在4.2min左右有部分内源性物质的小峰出
现，这说明如果化合物在这时候被洗脱下来，那么内源性物质就会一同下来，同时进入离子源，从而产生基质效应。为了避免这个问题，我们优化了色谱条件，将洗脱程序变缓，使内源性物质和待测得化合物分开，这样就减小了基质效应。

【3】质谱条件的选择
众所周知，基质效应在液质检测中有所体现，但在液相-紫外检测中却没有，这跟它们检测的原理是相关的。在液质分析中，我们经常使用的是电喷雾离子源（ESI）和大气压化学电离源（APCI）。ESI源由于其电离原理是液相离子化，内源性物质与待测物竞相竞争液滴表面，从而基质效应比较明显。所以我们在实际应用中，如果遇到使用ESI源基质效应较大，可以考虑换用APCI源尝试一下，看看响应是否能够满足要求，基质效应是否有所降低。同时，我们还可以考察一下正离子检测模式和负离子检测模式下基质效应的大小，一般情况下，负离子的背景噪音要低于正离子的。

【4】内标物的选择
在生物分析中，由于样品处理过程复杂，为了保证其操作的准确性，要使用内标来校正操作的误差。内标的选择，主要从同位素标记物和待测物的同系物里寻找。实际上，同位素标记物是最为理想的内标物，它与待测物的化学性质极为相似，基质效应、操作中的环境变化等对他们的影响也一致，这样就可以出去基质效应的影响。但是由于同位素标记物价格昂贵，而且不易获得，使这种优越性大打折扣，在不得已的条件下，还需要选择同系物来做为内标，这就需要通过其他几个方面来尽量的降低基质效应，以满足测定灵敏度和专属性的要求。

5.FDA关于基质效应的规定FDA在生物样品分析方法确证中对基质效应的规定——凡是使用液质建立生物样品分析方法时，必须考察基质效应对化合物测定的影响。当基质的影响控制在LLOQ的20%以下，这个方法才能被接受。

本文在前人工作的基础上，结合自己工作中的实例，对基质效应的定义、产生机制、评价方法及去除方法进行了系列的描述，希望对各位能够有所帮助。各位版友如有不同的意见，可以跟帖，我将和大家一起讨论、学习。