主题：【讨论】饲料中硝基呋喃类药物的HPLC检测方法

透析分析和在线HPLC测定禽肉中硝基咪唑类和硝基呋喃类药物的残留量
sg.3.4 Analysis with Dialysis and On-line HPLC for Determining Residues of Nitromidazoles and Nitrofurans in Poultry(chickens, ducks and turkeys) Meat


安全操作注意事项及急救：

安全
有机试剂：所有的有机试剂必须作为潜在的危险品处理，并且所有使用步骤必须在通风橱中操作。

引言
硝基咪唑类药物（本文指二甲硝嘧唑和甲硝咪乙酰胺）是使用于家禽的抗球虫剂。二硝基咪唑的最大残留限量（MRL）是10μg/kg；甲硝咪乙酰胺的最大残留限量（MRL）是2μg/kg，此两种硝基咪唑类药物具有共同的代谢产物：1－甲基－2－羟甲基－5－硝基咪唑。硝基呋喃类药物（本文指呋喃唑酮和呋喃它酮）是用于猪和家禽的抗菌剂。
1.主题内容
本工作依照残留指令（86/469/EEC）执行。
2.应用范围
本方法用于测定家禽肉中的二甲硝咪唑，甲硝咪乙酰胺以及它们共同的代谢产物1－甲基－2－羟甲基－5－硝基咪唑。该方法也包括禽肉中呋喃唑酮和呋喃它酮的监测。本方法作为一种常规监控方法，对于硝基咪唑类和1－甲基－2－羟甲基－5－硝基咪唑和呋喃唑酮的检测限是2μg/kg，对于呋喃它酮，其检测限为4μg/kg。
3.参考文献
93/256/EEC委员会指令，规定测定具有激素和甲状腺拮抗作用的物质残留的方法，［OJ.NL.118 ,14.4.93.pp64-74］
ISO标准78/2-1982对标准进行设计—第二部分：化学分析标准
ISO标准5725（1986）
Aerts,M.M.L,Beek,W.M.J. and Brinkman,U.A. Th.,（1990）,J.Chromatogr.500,453～468
Elema,M.C.,Beek,W.M.J. and Keuken,H.J（1992）,CF-LC. RIKILT-DLO,SOP N’ AO656. RIKILT,Wageningen,NL.
Kenkens,H.J.,Elema,M.C. Beek, W.M.J. and Boekestein,A.（1993） Proc.Euroresidues Ⅱ May 1993,PP 410-414.
4.定义
硝基咪唑类和硝基呋喃类含量是指按照所描述的方法检测，并表示为每kg实验样品中含有硝基咪唑类和硝基呋喃类药物的μg数，被检测的肉中含有的硝基咪唑类和硝基呋喃类药物的量。
5.原理
该方法所有的操作需在暗处避光操作，且由四个步骤组成：
—肉在水中均质
—离心
—用透析法进行提取物上清液的净化
—用配有UV的HPLC在320nm进行定量测定
6.材料
6.1化学试剂
6.1.1甲醇　分析纯　
6.1.2乙腈　HPLC级
6.1.3无水醋酸钠
6.1.4冰醋酸
6.1.5软化水，用Milli-Q净化系统纯化（Millipore，Milford，USA）
6.2溶液
6.2.1 0.01mol/L醋酸钠－醋酸缓冲液，pH4.3。在约800mL水中溶解0.82g无水醋酸钠（6.1.3），用冰醋酸（6.1.4）调节pH值到4.3，用水稀释到1L。
6.2.2 HPLC洗脱液，用850mL醋酸缓冲液（6.2.1）与150mL乙腈（6.1.2）混合,通过0.22μm的微孔滤膜过滤，并用超声水浴脱气。该溶液在一月内稳定。
6.3标准溶液
6.3.1二甲硝基咪唑和甲硝咪乙酰胺（），1-甲基-2-羟甲基-5-硝基咪唑，由Merck公司，Shark和Dohme赠送。呋喃唑酮和呋喃它酮从美国公司获得。
6.3.2 标准贮备液：在甲醇溶液中配制浓度为100μg/mL的硝基咪唑类和硝基呋喃类药物以及1-甲基-2-羟甲基-5-硝基咪唑标准溶液作为标准贮备液,该溶液在暗处4-8℃可保存1个月。
6.3.3 稀释标准液：精密吸取1mL标准贮备液（6.3.2）于100mL容量瓶中,用水稀释至刻度。
6.3.4 标准工作液： A（5ng/mL）;精吸0.5mL 6.3.3溶液于100mL容量瓶中,用水稀释至刻度。B（20ng/mL）;精吸2mL 6.3.3溶液于100mL容量瓶中,用水稀释至刻度。
7.仪器设备
7.1 玻璃器皿
7.1.1 刻度吸管
7.1.2 玻璃离心管
7.1.3 6mL玻璃试管
7.1.4 100mL容量瓶
7.1.5 常备实验室玻璃器皿
7.2 仪器
7.2.1 自动移液管
7.2.2 分析天平
7.2.3 冷冻离心机
7.2.4 冰箱：<-18℃
7.2.5 振动混合器
7.2.6 均质器。400型Stomacher实验室混合器。（Lameris,NL）
7.2.7 滤纸（Schleicher & Schuell 5951/2； 15cm）
7.2.8 pH计
7.2.9 洗脱液过滤系统；0.22μm.（Millipore 83813）
7.3 透析装置（见示意图）
自动进样器—透析模块系统由一个232-401型自动进样器，两个自动六孔阀（Rheodyne 7010型）,一个401型二级稀释器，一个Kel-F装配了CupropHan模（阻断10000-15000道尔顿）的平板透析器支架,具有370μL的供给体积和650μL的接受体积,一个能保持恒定无脉冲的流量为每分钟0.1-2mL的液相色谱泵（305型,Gilson）组成。稀释器装配了2支 5mL注射器。进样装置的样器盘必须被冷却到4℃,并保持试验样品为4℃。

　

7.4 HPLC仪器
基础系统：Gilson 305和805
保护柱：Bondapack / Corasil 37-50um,10mm×2.1mm内径
（Millipore 27248）
分析柱：Lichrosorb C-18, 5μm,200mm×3.0mm内径
记录仪：10mV,0.5cm/min（Kipp BD-41）
检测器：UV 320nm,0.002Aufs,Rise time 2 sec.（ABI 785A型）
流量：0.4mL/min
8.样品和取样程序
注意事项见6.3.1节和ISO文件78/2-1982,下列注意事项由2052/VI/84-EN的附录Ⅱ导出：
8.1 样品性质：肉、奶和蛋的样品应能够进行残留检测,只有样品在不被微生物腐败的情况下才可被检测。
8.2 样品体积：样品体积必须足够大,以便执行参考方法,并在需要时可进行重复分析。
8.3 样品收集后,必须冷冻保存在≤-20℃。
9.测定步骤
注意：所有操作步骤必须在暗处或避光操作。
9.1 肉样在韦林氏搀合器中混匀。
9.2 控制和空白样品：分别吸取0,100,200和500μL已稀释的标准液6.3.3于10g均质肉样中。
9.2.1 控制样品和空白样品以及 各10g混匀肉样品（试验样品）,在Stomacher（7.2.6）中用20mL水进一步均质3min。
9.3 转移这些材料到离心管中,在10℃、4000转/分钟离心5分钟。
9.4 用滤纸（7.2.7）进行过滤，滤液如介绍所述放于准备好的透析系统内。
9.5 透析—HPLC
根据以下步骤,标准工作液被注射到透析系统中,直到观察到一个稳定的基线和一致的峰高响应。
样品被放到自动进样器中,并且保持4℃。双样品剂量（2×370μL）导入到透析组件。2mL接受器溶液（水）由二级稀释器（DIL）吸取通过浓缩柱。完成透析以后，开启第二个六孔阀（Va.2）用水冲洗浓缩柱。已浓缩的样品用HPLC洗脱液（6.2.2）回洗至保护柱，再开启六通阀(Va.1)的泵洗至分析柱。被测物用UV检测器在320nm进行检测。
注意：该操作步骤（9.5）可用安装在232主机上的国产软件进行自动操作。
10. 计算结果
10.1 肉样中含量由下式得出：
含量（肉中）（mg/kg）=Hm/Hst ×Cst×f
Hm =样品中被测物的峰高
Hst=加入到空白样品中标准品的峰高。
Cst=空白样品中标准品的浓度（mg/kg）
f=稀释因子
10.2 回收率
肉样的回收率是在溶于水的标准品基础上进行测定的。结果为：
浓度 回收率%
μg/kg 2-OH-Metab Ronidazole Dimetridazole Furazolidone Furaltadon
5 82 91 90 109 84
10 89 90 92 99 85
20 94 93 93 96 76

10.3 根据欧盟93/256决议（按第五节）可疑的峰必须具有与标准品相同的保留时间。
11.特殊事例
12.方法注意点
硝基呋喃类药物遇光易分解,所有步骤应避光操作是十分必要的。
13.质量控制
14.检测报告
15.缩略语（略）
见手册12节附录Ⅰ中的缩写。
16.检验流程图
肉→水提取→透析→HPLC→计算结果

原文由 儒雅凤(liwei7893) 发表:
7.4 HPLC仪器
基础系统：Gilson 305和805
保护柱：Bondapack / Corasil 37-50um,10mm×2.1mm内径
（Millipore 27248）
分析柱：Lichrosorb C-18, 5μm,200mm×3.0mm内径
记录仪：10mV,0.5cm/min（Kipp BD-41）
检测器：UV 320nm,0.002Aufs,Rise time 2 sec.（ABI 785A型）
流量：0.4mL/min
8.样品和取样程序
注意事项见6.3.1节和ISO文件78/2-1982,下列注意事项由2052/VI/84-EN的附录Ⅱ导出：
8.1 样品性质：肉、奶和蛋的样品应能够进行残留检测,只有样品在不被微生物腐败的情况下才可被检测。
8.2 样品体积：样品体积必须足够大,以便执行参考方法,并在需要时可进行重复分析。
8.3 样品收集后,必须冷冻保存在≤-20℃。
9.测定步骤
注意：所有操作步骤必须在暗处或避光操作。
9.1 肉样在韦林氏搀合器中混匀。
9.2 控制和空白样品：分别吸取0,100,200和500μL已稀释的标准液6.3.3于10g均质肉样中。
9.2.1 控制样品和空白样品以及 各10g混匀肉样品（试验样品）,在Stomacher（7.2.6）中用20mL水进一步均质3min。
9.3 转移这些材料到离心管中,在10℃、4000转/分钟离心5分钟。
9.4 用滤纸（7.2.7）进行过滤，滤液如介绍所述放于准备好的透析系统内。
9.5 透析—HPLC
根据以下步骤,标准工作液被注射到透析系统中,直到观察到一个稳定的基线和一致的峰高响应。
样品被放到自动进样器中,并且保持4℃。双样品剂量（2×370μL）导入到透析组件。2mL接受器溶液（水）由二级稀释器（DIL）吸取通过浓缩柱。完成透析以后，开启第二个六孔阀（Va.2）用水冲洗浓缩柱。已浓缩的样品用HPLC洗脱液（6.2.2）回洗至保护柱，再开启六通阀(Va.1)的泵洗至分析柱。被测物用UV检测器在320nm进行检测。
注意：该操作步骤（9.5）可用安装在232主机上的国产软件进行自动操作。
10. 计算结果
10.1 肉样中含量由下式得出：
含量（肉中）（mg/kg）=Hm/Hst ×Cst×f
Hm =样品中被测物的峰高
Hst=加入到空白样品中标准品的峰高。
Cst=空白样品中标准品的浓度（mg/kg）
f=稀释因子
10.2 回收率
肉样的回收率是在溶于水的标准品基础上进行测定的。结果为：
浓度 回收率%
μg/kg 2-OH-Metab Ronidazole Dimetridazole Furazolidone Furaltadon
5 82 91 90 109 84
10 89 90 92 99 85
20 94 93 93 96 76

10.3 根据欧盟93/256决议（按第五节）可疑的峰必须具有与标准品相同的保留时间。
11.特殊事例
12.方法注意点
硝基呋喃类药物遇光易分解,所有步骤应避光操作是十分必要的。
13.质量控制
14.检测报告
15.缩略语（略）
见手册12节附录Ⅰ中的缩写。
16.检验流程图
肉→水提取→透析→HPLC→计算结果

感谢您的帮助，可是我是要用HPLC检测饲料中硝基呋喃类药物，不是残留。这几天用冰醋酸和乙腈做流动相，好像这类药物有分解现象，我也不知道该怎么做？还请指教！

原文由 raul-lei(Raul-lei) 发表:
最近在做呋喃类药物的检测，查了些文献，按照上面的方法，肯本做不出来呀！时间紧迫呀，本人十分着急，有那位好心人能帮助一下呀？
文献上有用乙酸铵和乙腈做流动相，跑梯度，可是做不出来？？
这类药物一般过哪种固相萃取柱呢？
跪求呀！等我威望积分涨了一定补加给提供给帮助的朋友!

按农业部1077号公告-2008方法可以做，我们当时过柱子用的是沃特斯的HLB萃取柱