主题：【第二届原创大赛】顶空气相色谱法测定中成药中有机残留物

2、色谱方法的建立
2.1色谱条件的选择
同时测定沸点相差较大的待测物，需采用程序升温。通过对不同升温条件的考察表明，起始温度过高，不利于低沸点有机残留溶剂的分离；起始温度过低，有机残留物检测方法时间太长，不利于样品的分析测定。另外，对程序升温的速率也进行了选择。本试验中由于二甲苯同分异构体的沸点较接近，因此在升温过程中此段升温速率有所降低，使各待测物达到完全分离。因此选择了以下条件：
检测器：FID检测器，温度250 ℃；进样口温度200 ℃；柱温：程序升温，初始温度50 ℃（2 min），以5 ℃/min的速率升至80 ℃，再由80 ℃以10 ℃/min 的速率升到160 ℃（2 min）；载气：高纯氮，流速0.5 mL/min。
2.2顶空自动进样条件的选择
由于同时测定沸点相差较大的8种有机溶剂，测定中发现顶空温度、顶空加热平衡时间及顶空瓶内压对各溶剂峰的峰面积影响较大，因此考察了顶空平衡温度分别为80，85，90 ℃，平衡时间分别为30，40，50，60 min及顶空瓶内压6、8、10、13、15 psi时各成分的出峰情况，结果表明顶空平衡时间在90 ℃，顶空平衡时间60 min，顶空瓶内压8 psi时各峰响应最大，确定顶空条件为：平衡温度90 ℃，顶空平衡时间60 min，顶空瓶内压8 psi。平衡时间60 min，加压时间0.5 min，定量环(1 mL)填充时间0.06 min，进样时间1 min。
顶空进样器


顶空进样瓶
有很多规格，我们的是10ml和20ml




垫片



压顶空瓶盖的东东


被起起来的瓶盖
因为铝盖没有了，所以大家就凑合看这个吧，嘿嘿

2.3 溶液的配制
2.3.1溶剂的选择 
分别考察了丙酮、乙酸乙酯、水杨酸甲酯为溶剂，结果显示均有杂质峰干扰待测物的测定。后考虑选择沸点较高的溶剂二甲亚砜或DMF，以避免对各待测物的干扰，但因为二甲亚砜毒性较大，故选择DMF作为有机溶剂。由于中成药中除含有多种中药成分外，还含有辅料，为减少样品基质效应，溶剂必须尽可能溶解样品。经试验，单一的DMF水溶液对样品的溶解度优于DMF水溶液的，有助于储备液的保存。以兼顾对样品的溶解和灵敏度为原则，选用2%DMF的水溶液为溶样溶剂，结果显示不干扰待测物的测定。
2.3.2 内标溶液的配制
精密吸取一定量乙苯，DMF为溶剂，定容到50ml量瓶中作为储备液；吸取一定量内标储备液，用水稀释配制成浓度为1.0 μg/mL的内标溶液，摇匀，待用。
2.3.3 对照品溶液的配制
精密吸取正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯标准品适量，置于同一25 mL量瓶中，DMF溶液定容，摇匀，得储备液。取储备液0.5 mL置25 mL量瓶中，以内标溶液定容，制成含正己烷、甲苯、对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯各20.0 μg/mL和含苯2.0 μg/mL的混合溶液，作为对照品溶液。精密吸取2.0 mL水和5.0 mL对照品溶液，置20 mL顶空瓶中以PTFE-硅胶垫和铝盖密封，待测。
2.4 专属性试验
经筛选，溶剂2％DMF水溶液不干扰待测溶剂正己烷、苯、甲苯、乙苯（内标）、对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯及二乙烯苯的测定，样品中杂质峰不干扰各待测溶剂，说明本法专属性强，结果见图


1．正己烷 2．苯 3．甲苯 4.乙苯5．对二甲苯 6．间二甲苯7．邻二甲苯 8．苯乙烯 9．DMF 10-13．二乙烯苯
细心的版友有可能会问，为什么二乙烯苯有4个峰——
那是因为高纯度的二乙烯苯对照品需在低温下保存，且提纯难度大，所以我用的是较低纯度(80％)的二乙烯苯对照品。其在气相色谱图上表现为4个色谱峰，通过测定记录各色谱峰面积，并计算各色谱峰所占的百分比，对其进行峰位的确定，结果表明，3号峰面积占 52.7%，为间二乙烯苯，4号峰占24.02 ，为对二乙烯苯，3，4号峰共占76.7%，与80%的二乙烯苯的检测报告基本相符，因此确定出峰顺序靠后的2个较大的色谱峰为二乙烯苯，所以用这两峰的峰面积之和作为定量依据。

2.5 线性关系考察
精密吸取对照品储备液0.3，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，置25 mL量瓶中，加入内标溶液适量，双蒸水定容，摇匀，得系列对照品溶液。制备顶空样品，测定。以各待测物色谱峰面积(Ai)与内标峰面积(As)之比(Ai/As)为纵坐标，各组分浓度C(μg/mL)为横坐标，进行线性回归。


2.6 精密度试验
取混合对照品溶液连续进样六次，正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯的RSD分别为4.5%，3.5%，0.8%，0.9%，1.5%，2.3%，2.3%，2.1%，均小于5.0％。
2.7 加样回收率试验
精密称取0.25 g样品共10份，分别置25mL量瓶中，其中9份依次加入0.4，0.5，0.6 mL的对照品储备液，加入相应浓度的内标储备液，双蒸馏水定容，超声1 min，测定。各取5.0 ml对照品溶液于20 ml顶空瓶中，依次加入双蒸馏水2.0 ml，密封。另一份加入7.0 ml相应浓度的DMF水溶液，密封，超声1 min，测定，用内标法计算结果如下：正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯的回收率分别为104.4%，117%，107.6%，102.0%，104.2%，103.2%，105.5%，99.7%。

好了，太晚了，今天先写到这里，明天继续努力，会有一些小心得和大家分享

后续已写好，做个电梯吧
后续内容

还是补上吧，这样比较直观一些，呵呵
由于我做实验的时候自己的实验室没有别人做过，所以所有的资料都是自己重头找的，当然也是那时候开始频繁的来到仪器信息网求助。得到了气相版月姐姐的很多帮助。呵呵，好下面我就分享一下做这方面实验室的一些小规范，都是我到处询问及查找的，如有不足之处望版友们指出
1.对于有机残留溶剂检测时检测器的选择：
一般选用FID检测器，对含卤素的有机溶剂如氯仿等，采用ECD检测器可得到更高的灵敏度。
2.对于气相色谱柱的选择
按照相似相溶的原理选择色谱柱。毛细管柱有极性柱、非极性柱、弱极性柱和中等极性柱。填充柱有高分子多孔小球或涂渍适宜固定液的填充柱。
我在做的过程也试过弱极性柱：HP-5，但是性质较为相似的对二甲苯和间二甲苯不能分离

现在所看到的1号峰就是对二甲苯和间二甲苯，2好峰时邻二甲苯
换了极性柱之后，分离度明显变好


6号峰时对二甲苯，7号峰是间二甲苯，8号峰是邻二甲苯
3.对于一个新手来说，用什么溶解标准样品真的是件挠头的事情，那么又应该怎么选择呢？
再还没有查找资料之前我就已经开始做了一部分，但是随着我查阅资料的增多，我发现了一个不成文的规律
顶空进样方法通常以水为溶剂，对于非水溶性的药物，可采用DMF、DMSO或其他适宜溶剂。溶液直接进样方法用水或合适的溶剂溶解样品。
水是首选溶剂，特别是顶空进样系统。
因为水中不含有机溶剂，故干扰较少，且在FID检测器上，以水为溶剂时，各残留溶剂的灵敏度最高。当药物不溶于水时，可加入适当的酸或碱以增加药物的溶解度，最好选用不挥发的酸或碱。以DMSO等为溶剂时，可加入一定量的水以增加检测的灵敏度，或用盐析的方法增加灵敏度。测定含氮的碱性溶剂时，供试品溶液应不呈酸性，以免被测物与酸反应后不易汽化。

4.关于取样量和样品瓶体积的问题
因为我们实验室有两种规格的顶空瓶，所以我两种都有试过，结果是这样子滴
由于相比(Vg/Vs)越小，灵敏度越大，我首先选择取样量为0.5 g，溶解于10mL溶剂中，样品瓶体积为20mL，取样量越大，基质效应越明显，尤其沸点高的有机残留溶剂如二乙烯苯回收率越低。于是，我就减小了取样量，这样二乙烯苯的回收率才合格
5.顶空进样法还要对顶空温度和顶空时间进行选择

按照常理大家都会觉得，顶空温度越高，顶空平衡时间越长，那么效果就应该越好，但是事实上并不是如此的
首先说说顶空的温度：
顶空温度应根据溶解供试品溶剂的特性及供试品中残留溶剂的沸点选择。以水为溶剂及测定低沸点残留溶剂时，顶空温度不宜超过85℃；测定沸点较高的残留溶剂时，通常选择较高的顶空温度；但此时应兼顾供试品的热分解特性，尽量避免供试品产生的挥发性热分解产物干扰测定结果。以DMSO为溶剂时，顶空温度不宜超过115℃。

话是这么说滴，但是也要根据自己的所测的物质决定，由于我测定的物质中有二乙烯苯，其沸点是198℃，经过考察，我选用了90℃的顶空温度。

再来说说顶空的时间：
顶空时间是要确保供试品溶液的气-液两相达到平衡，一般通过测定顶空时间与顶空气体浓度的浓度—时间曲线来确定。顶空时间不宜过长，一般为30～45分钟，如果超过60min，可能引起顶空瓶的气密性变差,导致定量的准确性降低。如果平衡时间选择多短，就不能保证气-液两相达到平衡。

设备很齐全呀。各方面工作也做得很到位。本来想为楼主空着几楼，留给楼主继续写写心得体会，是在忍不住了，请楼主原谅！楼主的文章对大家今后做类似的实验是有指导意义的，指导大家怎样去准备实验，如何去进行试验，实验结束后怎样去处理数据，楼主做的都很规范，谢谢楼主无私的分享！

我正在做溶剂残留很需要多点的资料，光注重

请问SFDA是什么机构？

原文由 symmacros(jimzhu) 发表:
请问SFDA是什么机构？

是国家食品药品监督管理局的简称。
仿照美国FDA，注意，是FDA，不是FBI

原文由 土老冒豆豆(土老冒豆豆) 发表:

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谢谢土豆代为解答，今天大扫除，刚结束，呵呵

原文由 coffee8(coffee8) 发表:
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谢谢coffe的鼓励，我会继续努力的