主题：【原创】用先进微生物监测方法研究深圳空气环境细菌总数和遗传多样性

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蜗牛

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发表于：2010/02/24 13:36:23 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

深圳市是华南地区新兴的大都市，人口稠密，工商业、电子制造业发达，交通繁忙，从近年气象要素和污染指数的变化情况看，空气质量总体有呈下降的趋势；深圳处于亚热带海洋季风气候带内，空气温湿，有利于空气微生物的生长繁殖，地面上人群呼吸带的微生物已经直接影响到人体健康。因此，监测深圳市区的空气微生物含量，对于提高深圳市区的大气环境质量和保障人体健康是十分必要的。

随着深圳市经济的发展和车辆的增多，城市空气污染也越来越严重。通过对空气微生物含量指标进行监测可以反映出空气的污染程度以及对人群健康造成的威胁。深圳市生态监测中，关于空气微生物的常规监测主要采用传统的平皿沉降法，此方法存在较多误差；我们将先进的荧光显微镜法和变性梯度凝胶电泳法（DGGE）引入监测工作中，作为深圳市生态监测体系中空气微生物监测方法的改进和补充。

变性梯度凝胶电泳法

分子生物技术克服了传统微生物培养技术的限制,可以更精确地揭示环境中微生物种群结构及其遗传的多样性，从而可以更加清楚的了解环境的变化及其与微生物的关系。其中，PCR-DGGE技术在遗传多样性等研究方面的应用较为广泛。

DGGE技术是rRNA基因测序中经常用到的一项DNA分离技术。由于不同种个体的rRNA基因的长度较稳定，DGGE能够将大小相似的不同序列DNA区分开，得到纯化的单一 rDNA，以便进行测序，从而可以获得更多有关微生物群落遗传学上的信息，即群落遗传多样性等信息。应用变性梯度凝胶电泳技术，对不同环境样品中的细菌微生物群落的遗传信息进行对比分析，结合环境的理化等指标，可以得到受不同程度污染的环境样品中的微生物遗传多样性的异同、微生物种类的变化等方面的信息，从而通过微生物指标来反映环境受污染的程度。

荧光显微镜法

利用微生物指标监测环境污染与清洁度是一种快速灵敏的生物学检测方法，通过对微生物DNA的染色所采用的荧光显微镜方法，能够检测到环境中绝大部分不能够被培养微生物类群，可以较好的降低常规培养皿培养所造成的微生物总量的损失或者过低估计等误差。此外，荧光显微镜检测方法还具有直观，快捷等特点。

目前，国内外将荧光显微镜方法应用于空气和海水中微生物的研究较为成熟可靠，并且得到了很好的研究结果；在土壤和沉积物中的微生物总数的研究上多采用培养皿的方法，我们希望通过前期的实验探索，可以将荧光显微镜的方法应用到土壤微生物总数监测工作中，并且与常规方法进行对比，检测该方法的可行性。

深圳空气环境微生物监测研究的区域为整个深圳市，测点集中在东部和西部区域，有杨梅坑、田心山、莲花山、羊台山和南山生态测站5个站点。

荧光显微镜分析
使用Syber Green I 染色剂染色土壤环境的细菌DNA，蓝光激发后，发亮绿色荧光；使用Olympus BX41显微镜，在油镜条件下随机选择10-20个视野计数被染色的细菌个体（细菌个数=平均视野中的细菌数量×滤膜的有效过滤面积/视野面积）,进行荧光显微镜计数（10×目镜，100×物镜，1000×倍数）亮绿色荧光的细菌细胞。

分子生物学分析
采用常规DNA提取方法对深圳空气环境细菌样品总DNA进行提取，得到的总DNA电泳结果图谱；

对测站的空气环境细菌样品DNA进行降落PCR扩增，得到PCR产物，作为DGGE的上样样品。对降落PCR扩增获得的产物进行琼脂糖电泳，进行DGGE实验（Touch Down PCR产物）。