主题：【第三届原创参赛】我的一次土壤中微生物主要类群的分离、记数及形态特征比较

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    大家好，小人再次与大家见面啦！！在刚刚结束的原创大赛7月比赛中我分享了自己的一次实验分析方法　（http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20100729/2690956/index.shtml），也受到了大家的鼓舞！！得到了版主的加分奖励，而且我注意到还在咱们论坛的首页分享了一段时间！！真是让我受宠若惊啊！！同时也极大的鼓舞了我！！于是——我又来参赛了！

    看到本次大赛可以奖品许愿，这样太好了，资源一点也不浪费啊！！这个月我就许愿：如果能够获奖，我希望得到一个电动牙刷嘿嘿！！！价值多少嘛就看获奖的等级啦！不过俺希望是高一点，这样就可以获得一个声波电动牙刷啦！！

    这次的内容是我对土壤中的微生物做的一次小的分离与分析，主要的目的是让自己了解土壤中的微生物，所以就不是那么的严格啦！！不过所有试验方法是参考多篇文献后最终确定的，虽不一定完全合理，但是也费了很大的心血和时间，请大家轻拍！！多多建议！！

        土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。

　　土壤中微生物主要有细菌、真菌、放线菌、藻类和原生动物。微生物以细菌数量最多，细菌占土壤微生物总量的70%～90%，且种类多，多数是异养菌。放线菌的数量仅次于细菌，多存在于偏碱性的土壤中，主要是链霉菌属、诺卡菌属和小单孢菌属等。

　　土壤中的微生物有些对农业有害。如反硝化细菌，能把硝酸盐还原成氨散失到大气中，降低土壤肥力。但多数是对农业有益的。1.一些异养的微生物，如某些腐生细菌，把土壤中的动、植物残体和有机肥料分解，然后再重新合成，对土壤肥力有重要的影响。2.有的可以增加土壤有机物质，固氮菌能固定空气中的氮，成为自身的蛋白质，当这些细菌死亡和分解后，其氮素即可被植物吸收利用，并使土壤中积累很多氮素。3.促进营养物质的转化，在土壤温度高、水分适当、通气良好的条件下，土壤中的好气性微生物活动旺盛，腐殖质分解，释放出其中的养分供植物吸收利用。硝化细菌能把有机肥料分解产生的氨转变为对植物有效的硝酸盐类。4.土壤中的真菌有许多能分解纤维素、木质素和果胶等，对自然界物质循环起重要作用。真菌菌丝的积累，能使土壤的物理结构得到改善。放线菌能产生抗生素。总之土壤中的微生物对增加土壤肥力、改善土壤结构、促进自然界的物质循环具有重要作用。

　　本实验通过采样、选择性培养、平板菌落计数(即活菌计数)、培养基的制备、高压蒸汽灭菌、等方法，对土壤中的微生物进行分离计数，并通过革兰氏染色等实验观察方法对微生物个体形态等进行培养与观察，以及制片染色技术等。结果发现土壤中微生物的含量极为丰富，除含有霉菌，细菌，放线菌之外还分离出固氮菌的菌种。通过比较对微生物形态等有所进一步的了解与认识。

　　2.材料与方法

　　2.1材料
        土样：以无菌方式采于学校附近农田，置于无菌容器中，待检

　　2.1.1培养基
　　营养琼脂；高氏一号固体培养基；查氏固体培养基；4阿须贝固体培养基；酵母膏-阿须贝固体培养基；无菌水

　　2.1.2染色液
　　革兰氏染色液；0.1%美蓝；乳酸石炭酸棉蓝液

　　2.2方法
　　2.2.1制备土壤稀释液

　　称取土样10g，放入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡，使土样与水充分混合，将细胞分散。静置，成为土壤悬液(10-1)。用1mL的无菌吸头从中吸取1mL土壤悬液注入盛有9mL无菌水的试管中，吹吸3次，振荡混匀(10-2)。然后再用同一支1mL吸头，从此管中吸取1mL注入另一盛有9mL无菌水的试管中(10-3)，依此类推制成10-4，10-5，10-6各种稀释度的土壤溶液。



      2.2.2制备及涂布平板

　　用一支1mlL无菌吸管分别从稀释度10-6、10-5和10-4的土壤稀释液中各吸取0.2mL菌液于已备好的2.1.2.1平板、2.1.2.2平板、2.1.2.3平板、2.1.2.4平板及2.1.2.5(分离自生固氮菌)平板上，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。涂布时从低浓度到高浓度分别在培养基表面轻轻地涂布，可转动皿底一定角度，继续涂布，直至均匀。每个浓度做3个平板。

　　2.2.3培养

　　将平板倒置于温箱中培养，培养温度及时间如下：

　　培养基2.1.2.1平板倒置于37℃培养箱，2～3天;培养基2.1.2.2平板倒置于28℃培养箱5～7天;培养基2.1.2.3平板倒置于28℃培养箱3～5天;培养基2.1.2.5平板倒置于28℃培养箱2～4天。统计每个平板长出的平均菌落数。根据下面菌落计数方法，算出每克土壤中的细菌含量。

　　2.2.4菌落计数 培养结束后，根据不同类群的微生物的菌落特征，分别在不同的培养基平板上统计相关类群的微生物菌落，即培养基2.1.2.1统计细菌的菌落;培养基2.1.2.2统计放线菌的菌落;培养基2.1.2.3统计霉菌的菌落，培养基2.1.2.5统计固氮菌的菌落。由下式计算每克土壤中含相关微生物的数量：



　　2.2.5挑单菌落 从不同的培养基平板上，选取细菌、放线菌和霉菌各三个菌落分别转接到相应的培养基斜面中，编号标记，分别置培养箱培养，备用

　　2.2.6自生固氮菌的影印培养 选择两个菌落分布较均匀的培养基2.1.2.5平板，用无菌影印工具将其上的菌落分别影印到两个培养基2.1.2.4平板上，28℃培养1～2天

　　2.2.7细菌的革兰氏染色和形态观察 对从2.2.6中选出的细菌分别做革兰氏染色，观察记录三株细菌的革兰氏染色结果和个体形态

　　2.2.8放线菌的插片培养和形态观察 对从2.2.6中选出的放线菌分别做插片培养，培养后观察记录三种放线菌的菌丝形态

　　2.2.9霉菌的点植培养和形态观察 对从2.2.6中选出的霉菌分别做点植培养，培养后观察记录三种霉菌的菌丝和产无性孢子的子实体的形态

　　2.2.10空气及皮肤或物品表面微生物的检测 制备培养基2.1.2.1平板三个并标记，其中一个打开培养皿盖，置于实验台上15分钟后,盖好皿盖，用于检测空气中的微生物;其他两个平板分别检测皮肤表面和纸币上的微生物，分别用手指和纸币在平板上涂抹;三个平板倒置于37℃培养箱培养

　　3.结果

　　3.1土壤样品中细菌、放线菌、霉菌的数量见表1



　　3.2土样中自生固氮菌的菌落数见表2 (菌落数/平板)


　　3.3分离的三株细菌的革兰氏染色结果及形态见表3

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　　3.4分离的放线菌的形态见图1

　　3.5分离的霉菌的形态见图2




　　3.6空气及皮肤或物品表面微生物的检测结果（纯属自我了解）

　　分别在牛肉膏蛋白胨平板上作如下实验：(1)未洗过的手指头在平板上涂抹;(2)用肥皂洗“净”的湿手指头(不要用手巾擦)在平板上涂抹;(3)用你正在使用的手巾或旧钱币轻轻在肉汤蛋白胨培养基上来回拖动2～3次。置30℃的培养箱培养48h观察结果。

　　通过培养观察可以发现未洗过的手指涂过的平板上生长有许多霉菌以及细菌的菌落，而用肥皂洗“净”的湿手指头涂过的平板上几乎没有菌落长出，用旧钱币涂过的平板上则有大量霉菌与细菌菌落，由此可见在日常生活当中细菌等微生物与我们的生活息息相关。