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主题：【第三届原创参赛】秀秀我们的实验室 SHOW一下(11月)

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发表于：2010/11/08 21:52:16 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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维权声明：本文为gl19860312原创作品，本作者与仪器信息网是该作品合法使用者，该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为，我们将追究法律责任。

本实验室 主要工作就是 微生物发酵与代谢调控 蛋白的分离纯化  蛋白的加工（ 化妆品 、面膜、人工血管 人工骨................)）
主要仪器 
5L、 12.8L、 50L、 500L等规格国际知名品牌（瑞士比欧、德国贝朗）全自动控制发酵罐，并带有尾气分析仪，同时还拥有高压均质机（丹麦 APV）、超滤系统（美国 Millipore和Pall）、大容量冷冻离心机（美国Sovall）、高速冷冻离心机、高效液相色谱（日本岛津）、电泳仪（美国Bio-rad）、凝胶成像系统、荧光显微镜（日本Nikon）、紫外可见分光光度计（美国 Unico）等等，所有设备级别达到世界一流高效、安全、无菌……，用于微生物高密度发酵从实验室小试研究到工业化生产。

实验仪器设备一览表

仪  器

型  号

厂  家

12.8L搅拌发酵罐

L1523

瑞士Bioengineering公司

空气压缩机

FB-45/7 

上海捷豹

恒温振荡培养箱

200B

上海志诚公司

高压灭菌锅

HV-50

日本TOMY公司

紫外检测器

UV 2501-PC

日本岛津公司

分光光度计

2082PCS

美国UNICO公司

精密pH计

F150

瑞士Mettler公司

分析天平

ALC-210.4

德国Sartorius公司

超纯水制备机

V6

奥联科技公司

高速大容量冷冻离心机

GL10MD

中国湘仪离心机仪器有限公司

高速冷冻离心机

BR4i

美国Thermo公司

超低温冰箱

ULT1386-3-V34

美国REVCO公司

高压匀浆机

APV1000

APV公司

超声波间歇破碎仪

JY98-III

宁波新芝仪器研究所

超滤膜设备

FS900M02B

美国Pall公司

尾气分析仪

LKM2000A

韩国LOKAS公司

电泳仪

Mini-ProteinⅡ

美国BioRad

脱色摇床

TS-2

海门Kylin-Bell仪器制造有限公司

凝胶成像系统

UVTransilluminator

日本UVP公司





                  蛋白质做成成品  研发中心实景图
  第一个  骨韧性 强度测试仪                 
第二个  高效液相HPLC
第三个  超声破碎

超声波间歇破碎仪

JY98-III

宁波新芝仪器研究所

凝胶成像系统

UV Transilluminator

日本UVP公司

超声波连续细胞破碎仪

SONICS

宁波新芝仪器研究所


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2010/11/8 21:56:24 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
生产中心混合室图

高密度发酵及过程优化

高密度发酵的影响因素

在之前人们利用一般的发酵工艺生产大肠杆菌或以其组建的基因工程菌表达产物时，存在生物量(大肠杆菌)、产物表达量在菌体内和发酵液中的浓度都较低的问题，因此生产效率和经济效益欠佳。应用高密度发酵的方法则可较好地解决上述问题，不但可获得较大的生物量，而且可显著提高目标产物的浓度。但该方法对发酵设备和发酵控制条件的要求比较高，而且影响因素非常多，如细菌生长所需的营养源、发酵过程中生长抑制物的积累、溶氧、培养温度、发酵液的pH值、补料方式以及发酵液的流变学特性等。

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2010/11/10 21:15:12 Last edit by gl19860312
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2010/11/8 21:58:09 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊

全自动发酵罐

12.8L搅拌发酵罐

L1523

瑞士Bioengineering公司

下面这张图 是30L的  也是瑞士公司    右边的是发酵控制面板  可以PH DO溶氧 转速
补料  温度  实时监控  \(^o^)/~

空气压缩机

FB-45/7 

上海捷豹

尾气分析仪

LKM2000A

韩国LOKAS公司


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2010/11/10 21:05:34 Last edit by gl19860312
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2010/11/8 22:00:28 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊

真空冷冻干燥机    蛋白产品的冷冻干燥 冻成干粉......


高压灭菌锅

高压灭菌锅

HV-50

日本TOMY公司




响应面优化法

目前常用的发酵实验优化方法包括响应面法、正交设计法和均匀设计法，其中近年来最广泛使用的是响应面法。1951年，Box和Wilson两位学者建立了响应面法，从而不仅使得响应面法成为一个完整的研究领域，而且极大地改变了科研人员做实验的方法，为筛选、确定范围、鉴定并优化过程/产物奠定了完整的实验设计理论基础。其基本思想是通过近似构造一个具有明确表达形式的多项式来表达隐式功能函数，本质上是一种统计学方法。它通过有序排布特定水平的实验因素来获得能够近似模拟实际实验状况的数学模型。响应面是指响应Y值与同一组输入值X1，X2，…，Xn之间存在函数关系式Y=F（X1，X2，…，Xn），则称由Y=F（X1，X2，…，Xn）所表示的曲面为响应面。在应用该种方法时，需作出以下三方面的假定:

（1） 该函数关系式存在，而且输入变量是连续的;

（2） 在较窄的范围内，函数F可以用一个低阶的多项式逼近;

（3） 在试验过程中，可以控制和度量输入量X1，X2，…，Xn。

响应值Y在三维空间中代表一张曲面。为便于目测其形状，常画出响应面的等高线。在等高线图中，每一条等高线对应于响应面的一个特定高度，这有助于研究导致响应面的形状或高度改变时输入量X1，X2，…，Xn的水平。

响应面法的基本程序是，1) 从众多因素中筛选出影响显著的因素。若需要考察的因素本来就很少，则该过程可省略。常用实验设计方法包括Plackett-Burman设计和分式析因设计等。2) 作最陡爬坡实验，以确定现有的实验条件或因素水平是否已接近响应面最优区域所对应的水平。最陡爬坡实验使用的一阶模型是

                              （1.2）

该模型采用的是正交一阶设计，采用最陡爬坡法在x1, x2, x3… xn区域搜索。若无曲度出现则继续进行一阶设计，若出现曲度则转为二阶设计。二阶设计的主要目的是通过构建模型来寻找因素的最佳水平，并考察因素之间的相互作用。二阶模型可以表示为

            　（1.3）



二阶设计方法包括Box-Behnken 设计（BBD）、中心复合设计（CCD）、Koshal设计和Hybrid设计等，其中最常见、最经典的响应面设计方法是BBD和CCD[58-60]。

1.5.1 Box-Behnken实验设计（BBD）

BBD (1960年由Box和Behnken 提出)是关于拟合响应面的三水平设计，这些设计是由2k个要因与不完全区组设计组合而成的。该种设计对所要求做的试验次数十分有效，并且是可旋转或近似可旋转的。BBD的每个因素编码为 （-1，0，l） 三个水平,所设计的实验点如图1.2所示。

图1.2  Box-Behnken实验设计的实验点

Figure 1.2  Experimental points of Box-Behnken design

整个试验由下面两部分构成：（1） 边中心点（Side Center Point，白色点表示）。除了一维自变量坐标为0外，其余维度的自变量坐标皆为±1。 在三个因子的情况下，共有12个边中心点。（2） 中心点 （Center Point，黑色点表示）。各点的三维坐标均为0。

1.5.2 中心复合设计（CCD）

CCD是在标准2k要因设计方案的基础上通过增加若干个点来实现的。这些点分布于坐标轴和原点上，其中坐标轴上的点具有旋转性和正交性的特点，而中心点可计算实验误差。通常选择6个或9个中心点。图1.3表示了三因素的中心复合设计的实验点。

图1.3  中心复合设计的实验点

Figure 1.3  Experimental points of central composite design



立方体点（Cube Point，灰色点）的各点坐标皆为1或-1，这与全因子试验相同。各中心点 （Center Point，黑色点）的三维坐标皆为0。轴点（Axial Point，白色点），除了一维自变量坐标为±1（旋转性指数）外，其余维度的自变量坐标皆为0。 在三个因子情况下，共有6个轴点。

通过对比图1.2和 1.3可以看出，适当选择CCD的轴点坐标和中心点数可以使CCD达到可旋转且精度一致的设计，从而为各个方向上的设计提供等精确度的估计。BBD不包含由各变量的上限和下限所生成的立方体区域的顶点处的任一点。当立方体顶点上的点所代表的因素水平组合由于成本过高或因实际限制而不可能进行时，BBD便展示出它所特有的优势[61]。
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2010/11/10 21:19:43 Last edit by gl19860312
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2010/11/8 22:01:23 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊


代谢流分析方法

代谢流平衡分析法是基于物料平衡和代谢网络固有的化学计量关系所形成的，该种方法只需选择合理的胞内代谢网络，建立化学反应计量关系矩阵，并通过胞外产物、生长代谢等的定量分析和拟稳态假设，将微分方程组化为代数方程组，可较容易得到胞内代谢流分布的数据。该方法不需要了解相关酶的参数，也无需考虑动力学背景，只应用简单的物料平衡和代谢网络知识，这对于设计和优化生化过程具有相当大的价值。其原理如下[50, 51]：

PCR仪

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2010/11/10 21:18:35 Last edit by gl19860312
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2010/11/8 22:03:09 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊

生物安全柜

PCR仪



高密度发酵的过程控制

针对上述影响高密度发酵的因素，人们对高密度发酵的工艺进行了大量的研究，以期获得更高的菌体密度和外源蛋白表达量。

优化培养基

培养基的组成因微生物种类而异，且不同高密度培养目的营养基质的配方也不同，例如：大量的研究结果表明，细菌在碳源限制的条件下生长，其生物能源的有效利用率最高；而在氮源限制的环境中生长的细菌，通常会在细胞中积聚糖原等多聚物，同时大量合成有机酸等中间代谢产物，这种现象在葡萄糖作为主要碳源时尤为突出。

因此，微生物高密度培养基设计原则通常有以下几条[32]：(1)使用最稀培养基以便精确设计营养成分与微生物生长之间的定量关系，同时避免任何不利于微生物生长的营养限制性因素；(2)利用碳源限制的方法直接阻断微生物对数生长期间抑制性代谢产物的合成；(3)依据微生物细胞的元素组成确定培养基各成分的精确配比，维持细菌以合适的比生长速率生长，减少培养过程中溶氧需求，避免或减少乙酸的产生。此外，理想的培养基中还应加入适量的维生素和微量元素。利用MATLAB软件可对优化培养基实验进行合理设计及计算实验结果，得出营养基质间的最优组合。

培育优良发酵种子

为尽可能的避免乙酸等代谢副产物的生成，获得高密度及高表达，一方面可从发酵调控入手，另一方面也可从改良菌种出发。优良的种子是降低生产成本、提高发酵效率的一个非常重要的因素。现在，人们利用基因工程手段接合代谢工程知识，构建出低乙酸或乙酸缺失优良的菌种。乙酸的生成需要两个关键性的酶，磷酸转乙酰酶(Pta)和乙酰激酶(Ack)，它们催化葡萄糖代谢中从乙酰辅酶A生成乙酸的两步酶促反应，若乙酸生成途径中的两个关键酶(Pta和Ack)有一个酶突变了或活性降低了，就会使乙酸的合成受阻。

发酵方式的选择

微生物的培养方式主要有分批培养、连续培养以及改进的分批-补料培养等。分批培养中接种后就不再加入或移去任何物质，微生物生长是按典型的生长曲线进行的。连续培养克服了分批培养中遇到的营养物耗尽以及细胞衰亡的问题，抑制性副产物不会积累，菌体生长一直处于指数生长期。分批-补料培养的特点是在分批培养的前提下连续地或按一定规律地向系统内补入营养物，使发酵系统中保持低的营养物浓度。其中，分批-补料培养已被确认为实现高密度、高表达的最有效的方法[33]，其优点在于：可消除快速利用碳源后造成的阻遏效应；避免培养过程中产生的抑制性副产物积累造成的毒害；避免由于菌体快速生长而发生的质粒不稳定问题。由于现在普遍采用限定培养基或半限定培养基作为发酵的基础培养基，所以分批-补料培养通常是以葡萄糖作为限制性碳源来补充，氨水则兼负补充碳源和调节pH的双重任务，从而大大简化了补料的成分。

补料-分批发酵方法最先应用于酵母菌的培养，现在亦广泛地应用在大肠杆菌的高密度发酵中。随着动力学研究的深入和测量与控制手段的进步，补料-分批发酵技术从无反馈控制操作发展到反馈控制操作。

流加方式的选择

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2010/11/10 21:16:26 Last edit by gl19860312
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大实验室  与  无菌室
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发酵室-发酵罐&种子罐    50L种子罐 500L发酵罐
      发酵室-系统控制台  微机操作

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2010/11/8 22:14:13 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
生测室微生物检验           
种子室-摇床培养箱

恒温振荡培养箱

TZ-2BD

北京沃德电子实验设备厂


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12.8L搅拌发酵罐      型号 L1523          购自瑞士Bioengineering公司
恒温振荡培养箱        型号 200B            购自上海志诚公司
高压灭菌锅            型号 HV-50          购自日本TOMY公司
紫外检测器            型号 UV 2501-PC      购自日本岛津公司
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精密pH计            型号pHS-3(0.01级)    购自德国赛多利斯公司
分析天平              型号ALC-210.4        购自德国Sartorius公司
高速冷冻离心机        型号BR4i            购自美国Thermo公司
高压匀浆机            型号APV            购自华粤公司
超声波间歇细胞破碎仪  型号SONICS          购自宁波新芝仪器研究所
超滤膜设备            型号FS900M02B      购自美国Pall公司
电泳仪                型号Mini-ProteinⅡ    购自美国BioRad
凝胶成像系统          型号UVTransilluminator 购自日本UVP公司
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分析天平    AE-50    瑞士Mettler
高压灭菌锅    HV-50    日本HIRAYAMA
恒温振荡培养箱    TZ-2BD    北京沃德电子实验设备厂
12.8L搅拌发酵罐    L1523    瑞士Bioengineering公司
分光光度计    UV-9100    北京瑞利分析仪器设备厂
液相色谱    2010c    日本岛津公司
精密数显酸度计    pHS-3(0.01级)    上海天达仪器有限公司
低速冷冻离心机    RC3B PLUS    美国SORVALL公司
超声波间歇细胞破碎仪    JY98-III    宁波新芝仪器研究所
超滤设备    FS900M02B    美国Pall公司
高压匀浆机    Rannie 5    丹麦APV
电泳仪    Mini-ProteinII    美国BioRad
层析装置    CZH012    华美公司
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