维权声明:本文为v3255306原创作品,本作者与仪器信息网是该作品合法使用者,该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为,我们将追究法律责任。
银黄颗粒质量标志物评价研究
摘要目的:以黄芩药材、金银花药材、黄芩提取物、金银花提取物、银黄制剂为研究对象,考察并优化了样本在前处理环节的回流提取溶剂的体积、回流提取时间和提取溶剂的温度等。方法:采用高效
液相色谱法,色谱柱为Venusil MP C
18(4.6mm × 250 mm,5μm), Venusil MP C
18(4.6mm × 250 mm,3μm)和 Agela MP S/N。以乙腈一0.3% 磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱,流速为0.7 mL·min
-1,检测波长为235 nm。结果和结论:通过各方面的考察,确定了银黄颗粒、黄芩药材和金银花药材在样品前处理环节的工艺优化参数,为银黄颗粒质量标志物研究提供借鉴指导。结论: 建立的提取方法稳定、可靠,有效成分达到最大提取效率,可用于银黄颗粒溯源检测的质量控制和综合评价。
关键词:银黄颗粒;质量标志物;高效
液相;黄芩;金银花
Evaluation of Quality Markers of Yinhuang Granules
Objective: To investigate and optimize the volume ofreflux solvent, reflux extraction time and temperature of extraction solvent inthe pretreatment of samples, taking Scutellaria baicalensis, honeysuckle,Scutellaria baicalensis extract, honeysuckle extract and Yinhuang preparationas research objects. METHODS: High performance liquid chromatography was usedwith Venusil MP C18 (4.6 mm *250 mm, 5 micron), Venusil MP C18 (4.6 mm *250 mm,3 micron) and Agela MP S/N as chromatographic columns. The gradient elution was carried out with acetonitrile-0.3% phosphoric acid solution as mobile phase.The flow rate was 0.7 mL/min and the detection wavelength was 235nm. RESULTS AND CONCLUSION: The process optimization parameters of Yinhuanggranules, Radix Scutellariae baicalensis and Flos Lonicerae in samplepretreatment were determined through various aspects of investigation, whichcould provide reference and guidance for the study of quality markers ofYinhuang granules. CONCLUSION: The established extraction method is stable andreliable, and the effective ingredients can reach the maximum extractionefficiency. It can be used for quality control and comprehensive evaluation oftraceability detection of Yinhuang granules.
Keywords: Yinhuang granules; quality markers; high performance liquidchromatography; Scutellaria baicalensis; honeysuckle
一、前言 银黄颗粒组方由金银花和黄芩构成,具有清热疏风、利咽解毒的功效,用于外感风热、肺胃热盛所致的咽干、咽痛、喉核肿大、口渴、发热急慢性扁桃体炎、急慢性咽炎、上呼吸道感染等症。该复方原料金银花为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或带初开的花,主产于山东、河南和河北等地。该复方原料黄芩为唇形科
黄芩属多年生草本植物,产于河北,河南,陕西,山西,山东等地。黄芩提取物的主要活性成分为黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素,金银花提取物是从金银花中提取的有机酸类活性成分。该制剂及其原料药成分复杂,生产厂家及产地众多,样品存在差异。中药质量标志物(Q-marker)已广泛应用于中成药的质量评价与控制。近年来越来越多的研究使用不同种类的分析仪器,密切联系中药有效性-物质基础- Q-marker研究,建立了丰富的中成药系统质量控制方法,为探讨建立中药全过程质量控制及质量溯源体系奠定了基础。
二、材料与方法
1仪器与试剂、试药
1.1仪器 Waters e2695高效
液相色谱仪(美国Waters公司),Waters 2998紫外检测器(美国Waters公司),Waters Empower色谱工作站(美国Waters公司);AGBP210S电子天平(Sartorius公司);MILLIPORE纯水机(MILLIPORE公司);高速万能粉碎机(北京市永光明医疗仪器有限公司,FW-80型);SB4200DTS超声波双频清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司);KDM-A控温电热套(金坛市医疗仪器厂);Venusil MP C
18(4.6 mm × 250 mm,5 μm)和Venusil MP C
18(4.6 mm × 250 mm,3 μm)。
1.2 试剂与试药 乙腈(上海星可高纯溶剂有限公司,色谱纯);甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司,色谱纯);其余试剂均为分析纯,水为超纯水。
对照品来源:葛根素(批号:110752-200912)购自中国食品药品检定研究院。
2样品的收集与前处理
2.1样品的收集 本研究从全国范围内收集黄芩、金银花药材各50批,分别制备相应的黄芩提取物和金银花提取物各50批,并制备银黄颗粒样品至少50批。(共计不少于250批样品)。
2.2黄芩、金银花药材的处理 对收集到的各批样品,均按照《中国药典》2015年版(第四部)药材取样法,四分法取样,1/4留样,剩余药材粉碎,使粉末分别过60目和20目筛,并按比例称重。所有黄芩、金银花药材样品均装袋密封,保存于冰柜(-20℃)中,备用。
2.3黄芩提取物的制备 取黄芩约100 g,置于1000 ml容量瓶中,加热回流两次,每次2 h,将滤液置于烧杯中浓缩至200 ml,用2 mol/L的盐酸调PH至1.0-2.0,80 ℃保温1 h,静置24 h.减压抽滤,沉淀加一倍量水混匀,用40 %氢氧化钠调节PH至7.0,加等量乙醇,搅拌溶解,滤过,滤液用2 mol/L的盐酸调PH 1.0-2.0, 60 ℃保温1 h,静置24 h,滤过,沉淀物加水洗至PH 5.0,95%乙醇洗至中性,挥尽乙醇,干燥,即得。
表1 黄芩提取物的提取
![]()
2.4金银花提取物的制备 称取金银花50.05 g置于圆底烧瓶中,加纯水回流提取三次,第一次8倍量水400 ml回流提取1 h,滤过,残渣加8 倍量水400 ml二次回流提取1 h,滤过,合并煎液,残渣加6倍量水300 ml,合并煎液,浓缩成浸膏,加浸膏量50%的淀粉混匀,置于烘箱中,60 ℃干燥,粉碎成粉,即得。
表2 金银花提取物的提取
![]()
3供试品溶液方法考察的制备
3.1供试品溶液制备方法考察
3.1.1提取溶剂的选择 根据银黄颗粒的服用说明,该样品采用水为溶媒制备供试品溶液,由于临床应用中黄芩,金银花多采用水煎内服的用法,因此研究中以水作为提取溶媒,制备样品溶液。
3.1.2内标物溶液的制备 经查阅大量文献,本实验适用的内标物为葛根素。取葛根素对照品适量精密称定,以水超声溶解并定容制成浓度为30 μg*mL
-1的内标溶液
3.2银黄颗粒供试液制备方法考察
3.2.1银黄颗粒不同料液比的考察 银黄颗粒研细后精密称取细粉1.0 g,称四份,置于100 ml或250 ml的圆底烧瓶中,分别精密加入煮沸的蒸馏水25 ml、50 ml、100 ml、150 ml于圆底烧瓶中,称重,加热回流30 min,回流后放冷,补重,过滤,取续滤液。将样品溶液与内标溶液经0.45 μm微孔滤膜滤过后0.5 ml等体积混匀,作为供试品溶液,注入高效
液相色谱仪,按照既定方法采集色谱指纹图谱,计算各共有峰的单位质量的峰面积值,比较其差异,结果见表3、图1。
表3 银黄颗粒不同料液比单位质量色谱峰面积比较
![]()
图1 银黄颗粒不同料液比单位质量色谱峰面积比较
![]()
由上述表图分析:各主要共有峰的单位质量峰面积在提取体积为100 ml时值最大,最终选择回流提取体积为100 ml。
3.2.2银黄颗粒不同提取时间的考察 银黄颗粒研细后精密称取细粉1.0 g,称四份分别置于100 ml 的圆底烧瓶中,精密加入煮沸的蒸馏水25 ml于圆底烧瓶中,称重,分别加热回流20 min、30 min、40 min、60 min,回流后放冷,补重,过滤,取续滤液。将样品溶液与内标溶液经0.45 μm微孔滤膜滤过后0.5 ml等体积混匀,作为供试品溶液,注入高效
液相色谱仪,按照既定方法采集色谱指纹图谱,计算各共有峰的单位质量的峰面积值,比较其差异,结果见表4、图2。
表4 银黄颗粒不同提取时间单位质量色谱峰面积比较
![]()
![]()
图2 银黄颗粒不同提取时间单位质量色谱峰面积比较
由上述表图分析:各主要共有峰的单位质量峰面积在提取时间为30 min时值最大,最终选择回流提取时间为30 min。
3.2.3银黄颗粒冷热水的考察 银黄颗粒研细后精密称取细粉1.0 g,称两份分别置于250 ml的圆底烧瓶中,第一份精密加入煮沸的蒸馏水100 ml于圆底烧瓶中,第二份精密加入100 ml常温蒸馏水,称重,加热回流30 min,回流后放冷,补重,过滤,取续滤液。将样品溶液与内标溶液经0.45 μm微孔滤膜滤过后等体积混匀,作为供试品溶液,注入高效
液相色谱仪,按照既定方法采集色谱指纹图谱,计算各共有峰的单位质量的峰面积值,比较其差异,结果见表5、图3。
表5 银黄颗粒冷热水单位质量色谱峰面积比较
![]()
![]()
图3 银黄颗粒冷热水单位质量色谱峰面积比较
由上述表图分析:各主要共有峰的单位质量峰面积在提取溶剂为热水时值最大,最终选择提取溶剂为热水。
3.3黄芩药材供试液制备方法考察
3.3.1黄芩药材不同料液比的考察 按比例称取2 0~60目和过60目筛的黄芩药材粉末,共0.57 g,称取三份,置于100 ml或250 ml的圆底烧瓶中,分别精密加入煮沸的蒸馏水25 ml、50 ml、100 ml于圆底烧瓶中,称重,加热回流30 min ,回流后放冷,补重,过滤,取续滤液。将样品溶液与内标溶液经0.45 μm微孔滤膜滤过后等体积混匀,作为供试品溶液,注入高效
液相色谱仪,按照既定方法采集色谱指纹图谱,计算各共有峰的单位质量的峰面积值,比较其差异,结果见表6、图4。
表6 黄芩药材不同料液比单位质量色谱峰面积比较
![]()
![]()
图4 黄芩药材不同料液比单位质量色谱峰面积比较
由上述表图分析:各主要共有峰的单位质量峰面积在提取体积为50ml时值最大,最终选择50ml为最佳提取容积。
3.3.2黄芩药材不同提取时间的考察 按比例称取2 0~60目和过60目筛的黄芩药材粉末,共0.57 g,称取四份,分别置于100 ml 的圆底烧瓶中,精密加入煮沸的蒸馏水25 ml于圆底烧瓶中,称重,分别加热回流20 min、30 min、40 min、60 min ,回流后放冷,补重,过滤,取续滤液。将样品溶液与内标溶液经0.45 μm微孔滤膜滤过后等体积混匀,作为供试品溶液,注入高效
液相色谱仪,按照既定方法采集色谱指纹图谱,计算各共有峰的单位质量的峰面积值,比较其差异,结果见表7、图5。
表7 黄芩药材不同提取时间单位质量色谱峰面积比较
![]()
![]()
图5 黄芩药材不同提取时间单位质量色谱峰面积比较
由上述表图分析:各主要共有峰的单位质量峰面积在提取时间为40 min时值最大,最终选择40 min为最佳提取时间。
3.3.3黄芩药材冷热水提取的考察 按比例称取2 0~60目和过60目筛的黄芩药材粉末,共0.57 g,称取二份,置于100 ml的圆底烧瓶中,第一份精密加入煮沸的蒸馏水50 ml于圆底烧瓶中,第二份精密加入50 ml常温蒸馏水,分别称重,加热回流40 min,回流后放冷,补重,过滤,取续滤液。将样品溶液与内标溶液经0.45 μm微孔滤膜滤过后等体积混匀,作为供试品溶液,注入高效
液相色谱仪,按照既定方法采集色谱指纹图谱,计算各共有峰的单位质量的峰面积值,比较其差异,结果见表8、图6.
表8 黄芩药材冷热水单位质量色谱峰面积比较
![]()
![]()
图6 黄芩药材冷热水单位质量色谱峰面积比较
由上述表图分析:各主要共有峰的单位质量峰面积在提取溶剂为热水时值最大,最终选择热水提取是最佳的。
3.4金银花药材供试液制备方法考察
3.4.1金银花药材不同料液比的考察 按比例称取2 0~60目和过60目筛的金银花药材粉末,共0.5 g,称取三份,置于100 ml或250 ml的圆底烧瓶中,分别精密加入煮沸的蒸馏水50 ml、100 ml、200 ml于圆底烧瓶中,称重,加热回流30 min,回流后放冷,补重,过滤,取续滤液。将样品溶液与内标溶液经0.45 μm微孔滤膜滤过后等体积混匀,作为供试品溶液,注入高效
液相色谱仪,按照既定方法采集色谱指纹图谱,计算各共有峰的单位质量的峰面积值,比较其差异,结果见表9、图7。
表9 金银花药材不同料液比单位质量色谱峰面积比较
![]()
![]()
图7 金银花药材不同料液比单位质量色谱峰面积比较
由上述表图分析:各主要共有峰的单位质量峰面积在提取容积为100 ml,200 ml时值较大,100 ml与200 ml比较,两者的成分含量差别不大,所以选择100 ml提取较好。
3.4.2金银花药材不同提取时间的考察 按比例称取2 0~60目和过60目筛的黄芩药材粉末,共0.5 g,称取四份,分别置于250 ml 的圆底烧瓶中,精密加入煮沸的蒸馏水100 ml于圆底烧瓶中,称重,分别加热回流20 min、30 min、40 min、60 min ,回流后放冷,补重,过滤,取续滤液。将样品溶液与内标溶液经0.45 μm微孔滤膜滤过后等体积混匀,作为供试品溶液,注入高效
液相色谱仪,按照既定方法采集色谱指纹图谱,计算各共有峰的单位质量的峰面积值,比较其差异,结果见表10、图8。
表10 金银花药材不同提取时间单位质量色谱峰面积比较
![]()
![]()
图 9 金银花药材冷热水提取单位质量色谱峰面积比较
由上述表图分析:各主要共有峰的单位质量峰面积在提取溶剂为热水时值最大,最终选择热水提取最佳。
3.5 黄芩提取物,金银花提取物供试液制备方法考察 通过实验得知黄芩提取物,金银花提取物供试液制备方法考察同银黄颗粒供试液制备方法考察一致。
3.6 含葛根素内标的银黄颗粒、黄芩药材、金银花药材、黄芩提取物、金银花提取物供试液配制方法的确定
3.6.1含葛根素内标银黄颗粒供试品溶液的配制 银黄颗粒研细后精密称取细粉1.0 g,置于250 ml圆底烧瓶内,精密加入煮沸的蒸馏水100 ml,称重,加热回流30 min(提前打开电热套预热),放冷,补重,过滤,取续滤液。另取葛根素对照品适量精密称定,以水超声溶解并定容制成浓度为30μg•mL-1的内标溶液。将样品溶液与内标溶液经0.45 μm微孔滤膜滤过后等体积混匀,作为供试品溶液。
3.6.2含葛根素内标黄芩药材供试品溶液的配制 从冰柜中取出黄芩药材粉末,放置室温。采用四分法取样,按比例称取2 0~60目和过60目筛的黄芩药材粉末,共0.57 g,置于100 ml圆底烧瓶中,精密加入煮沸的蒸馏水50 ml,称重,加热回流40 min(提前打开电热套预热),放冷,补重,过滤,取续滤液。另取葛根素对照品适量精密称定,以水超声溶解并定容制成浓度为30 μg•mL-1的内标溶液。将样品溶液与内标溶液经0.45 μm微孔滤膜滤过后等体积混匀,作为供试品溶液。
3.6.3含葛根素内标金银花药材供试品溶液的配制 从冰柜中取出金银花药材粉末,放置室温。采用四分法取样,按比例称取2 0~60目和过60目筛的黄芩药材粉末,共0.25 g,置于100 ml圆底烧瓶中,精密加入煮沸的蒸馏水50 ml,称重,加热回流30 min(提前打开电热套预热),放冷,补重,过滤,取续滤液。另取葛根素对照品适量精密称定,以水超声溶解并定容制成浓度为30 μg•mL-1的内标溶液。将样品溶液与内标溶液经0.45 μm微孔滤膜滤过后等体积混匀,作为供试品溶液。
3.6.4含葛根素内标金银花提取物供试品溶液的配制 从冰柜中取出金银花提取物粉末,按比例精密称取0.2 g,置于250 ml圆底烧瓶中,精密加入煮沸的蒸馏水100 ml,称重,加热回流30min(提前打开电热套预热),放冷,补重,过滤,取续滤液。另取葛根素对照品适量精密称定,以水超声溶解并定容制成浓度为30 μg•mL-1的内标溶液。将样品溶液与内标溶液经0.45 μm微孔滤膜滤过后等体积混匀,作为供试品溶液。
3.6.5含葛根素内标黄芩提取物供试品溶液的配制 从冰柜中取出黄芩提取物粉末,按精密称取0.04 g,置于250 ml圆底烧瓶中,精密加入煮沸的蒸馏水100 ml,称重,加热回流30 min(提前打开电热套预热),放冷,补重,过滤,取续滤液。另取葛根素对照品适量精密称定,以水超声溶解并定容制成浓度为30 μg•mL-1的内标溶液。将样品溶液与内标溶液经0.45 μm微孔滤膜滤过后等体积混匀,作为供试品溶液。
三、结论 实验考察了银黄颗粒在样本处理环节的回流提取溶剂的体积、回流提取时间和提取溶剂的温度等。最终选择回流提取体积为100 ml,选择回流提取时间为30 min,选择提取溶剂为热水。考察了黄芩药材在样本处理环节的回流提取溶剂的体积、回流提取时间和提取溶剂的温度等。最终选择50ml为最佳提取容积,选择40 min为最佳提取时间,选择热水提取是最佳的。考察了金银花药材在样本处理环节的回流提取溶剂的体积、回流提取时间和提取溶剂的温度等。最终选择100 ml体积提取溶剂,选择30 min提取是最佳的,选择热水提取最佳。本实验还确定了含葛根素内标的银黄颗粒、黄芩药材、金银花药材、黄芩提取物、金银花提取物供试液配制方法。
参考文献
王亚丹,杨建波,戴忠,等.中药金银花的研究进展.药物分析杂志,2014,34(11):1928-1935
中国药典.一部.2015:1498
王彩芳,张楠,黄龙,等. HPLC法测定不同厂家银黄颗粒中黄芩苷的含量.医药论坛杂志,2006,27(24):27-28
王彩芳,黄龙,程茜,等.高效
液相色谱法测定不同厂家银黄颗粒中绿原酸的含量.时珍国医国药,2007,18(5):1143-1144
黄雄,黄嬛,王峻,等.银黄颗粒的HPLC特征图谱分析.药物分析杂志,2009,29(8):1320-1323
肖小河,王永炎.从热力学角度审视和研究中医药.国际生物信息与中医药论丛.新加坡:新加坡医药卫生出版社,2004:74
贺福元,罗杰英,刘文龙,等.中药谱效学研究方向方法初探.世界科学技术-中医药现代化,2004,6(6):44-50
赵渤年,于宗渊,丁晓彦,等.黄芩质量评价谱-效相关模式的研究.中草药,2011.42(2):380-383
高燕,赵渤年,于宗渊等.金银花抗流感病毒毒谱-效相关质量评价模式的研究.中华中医药杂志,2013.28(12):3508-3511
Ke Li, Wei Cheng, Xiao-Jian Liu, hu-Bin Li, En-Guang Hou, Yan Gao, Liang Wang, Qing Liu, Bo-Nian Zhao, Zong-Yuan Yu, Mathematical Modelling for the Quality Evaluation of BaikalSkullcap Root, Applied Mechanics and Materials, 2011
王荣梅,徐丽华,林永强.HPLC法同时测定银黄含片中6个咖啡酰奎宁酸类成分的含量.药物分析杂志,2012,32(1):57-60
高苏亚,范涛,王黎等.红外光谱技术结合化学计量学方法在中药研究中的应用.应用化工,2012,41(2):324-328
王鹏,王振国,薛付忠等.基于支持向量机法的中药性状与药性相关性研究. 江西中医药,2012,43(355):65-68
Cifford MN, Johnston KL, Knight S et al. Hierarchical scheme for
LC-MS identification ofchlorogenic acids.J Agric Food Chem,2003;51(10):2900-2910
张倩,张加余,隋丞琳,等. HPLC-DAD-ESI-MS/MS研究金银花水提工艺中绿原酸类成分的变化规律.中国中药杂志,2012;37(23):3564-3567
沈红,段金廒,钱大玮,等.黄芩及复方野马追胶囊中黄酮类成分的
LC-MS/MS分析.药物分析杂志,2009;29(9):1425-1429
赵胜男,李守拙.黄芩药材中黄酮类成分的HP
LC-MS研究.承德医学院学报2012;29(4):345-347
Chkoshi E, Nagashima T, Sato H, et al. Simple preparation ofbaicalin from Scutellariae Rdixi. JChromatogr A,2009; 1216(11): 2192 -2194
高燕,吕凌,王亮,等.银黄颗粒HPLC指纹图谱与模式识别分析.中华中医药杂志,2017,32(09):4238-4242
丁晓彦,刘青,李岩,等.丹参脂溶性成分的HPLC指纹图谱及模式识别研究.中华中医药杂志,2016,3(6):2254-2256