在高效液相色谱分析中，80%以上使用反相色谱柱。而反相色谱柱中，使用最多的是C18柱，这种固定相主要通过疏水作用保留和分离分析物。在过去几十年里，许多厂家设计生产出修饰过但是同样归属于USP L1的C18反相柱，它们在提供疏水作用的同时，还可以提供其他作用力（比如氢键作用、偶极作用等），使得反相柱的分析应用范围大幅扩大（可参阅“爱色谱”文章HPLC方法开发重要但容易被忽略的一步——合理地选择色谱柱）。常见的C18固定相的修饰方法有：（1）极性基团封端在游离的硅醇基上，（2）极性基团镶嵌在固定相的长烷基链中，以及（3）极性基团键合在固定相的长烷基链的尾端。

但是无论是常规的还是修饰过的C18柱，它们主要还是用来分离一些非极性或是弱极性的分析物，而对于一些大极性分析物还是无法保留。当极性分析物无法被反相色谱柱保留时，HILIC（亲水作用色谱）柱逐渐成为首选。HILIC柱中有亲水的固定相，而流动相使用高比例的有机相（一般使用70-97%的乙腈与缓冲液混合），有利于质谱分析。在HILIC模式中，决定保留的作用主要有两种：（1）分析物在流动相和固定相表面的水相的分配比例（反相色谱柱的分离机制是分析物在有机相和疏水固定相的分配比例，所以HILIC柱也有“反反相色谱”柱之称）和（2）分析物和亲水固定相的相互作用。

虽然HILIC对大极性化合物有好的保留和分离效果，但是很多大极性化合物无法溶解在高比例有机相中，这极大地限制了HILIC的使用；同时，HILIC需要比较长的平衡时间，也会相对容易出现重现性的问题，这也让不少使用者对HILIC退避三舍。此外，和反相恰好相反，HILIC只保留大极性化合物（一般要求logP<0），而对小极性化合物几乎没有保留，因此当分析物中同时含有极性跨度大的化合物，比如同时存在小极性、大极性和超大极性化合物时，就无法使用单一的上述两类色谱柱达到分离的效果。

离子交换色谱是分析离子化合物的另一种选择，根据离子分析物的大小和阴阳离子的差异而分离。同样的这种色谱柱的分离就是单一的离子交换作用，离子交换顾名思义，一般只能用来分析离子化的化合物。

1986年，Halfpenny和Brown首次提出了混合模式色谱（Mixed-Mode Chromatography）柱（后文简称混合柱）的概念，他们使用的混合柱是在同一色谱柱中结合反相和离子交换两种不同的作用模式，利用这类色谱柱来分离离子和非离子的核苷酸。从那时起对混合色谱柱的研发和应用逐渐成为行业热点，部分研发出来的混合柱也逐渐在市面上销售，渐渐被色谱分析人员注意和使用。

混合柱可以有疏水、亲水、离子交换和离子排斥等多重作用，即使分析物中同时含有极性和非极性、可离子化和中性、有机和无机化合物，都可以通过调整有机溶剂比例、缓冲液种类、缓冲液浓度或是pH而调整疏水、亲水或是离子交换的作用力，从而实现满意的分离效果。

下图可以展示混合柱的优势。纵坐标代表分析物的疏水强弱（反相色谱），由下而上出峰顺序为1，2，3，4，5，6，7，其中峰1，2，3重叠，峰4，5接近，峰6，7接近，左上角反相谱图即显示出这种结果。横坐标代表分析物的离子交换强弱（离子交换色谱），由左而右出峰顺序6，2，1，4，5，3，7，其中峰2，6接近，峰1，4接近，峰3，5，7接近，右下角离子交换谱图即显示出这种结果。当两者作用结合起来，就得到中线的混合柱分离坐标，样品得到顺序为2，1，4，3，5，6，7的完美分离，右上角谱图显示这种结果。

下面将系统介绍混合柱的发展、类型、选择以及流动相优化。

（1）混合柱的发展过程和常见类型

初期的混合柱就是未封端的C18柱（图1A），设计者正是利用其未封端的游离硅醇基提供离子交换作用。这类柱子的缺点是离子数量不易控制，以至于产生重现性不佳的问题；另一个问题是硅醇基离子化的可操作pH范围比较窄，因此也限制了它的使用。另一类混合柱就是将反相和离子交换两种不同固定相的颗粒通过机械混合后填装到同一色谱柱中，从而得到混合柱的分离效果（图1B），但是这类色谱柱同样存在重现性的问题。这两类色谱柱可以算是第一代的混合柱。

图1 第一代混合柱

为了解决重现性的问题，研究人员设计出了键合型的第二代混合柱，也就是将带有离子交换作用的官能团镶嵌在烷基链内（图2A）或者键合在烷基链尾端（图2B）。这一类的混合柱可以分离含有酸性，碱性或是中性的混合物。例如在低酸条件下，酸性化合物成非离子状态，和中性化合物一样，由疏水作用来主导分离效果，而分析物中的碱性化合物就可以经由离子交换而获得保留。

图2 第二代混合柱

第三代的混合柱则同时包括阳离子和阴离子交换的作用力，也同时具有疏水作用（图3A）或是亲水作用的作用力（图3B）。因此在这类混合柱可以同时保留阴离子、阳离子和疏水化合物或亲水化合物，也可以通过调节流动相的pH或是缓冲液的浓度来控制出峰的时间或顺序。

（2）如何筛选混合柱

筛选混合柱首先要了解分析物的特性和混合柱固定相的结构或是主要作用模式（注1），然后根据分析物的特性找出相对应作用模式的混合柱。以下可以作为各类分析物如何选择混合柱的参考：

注1：有些厂家由于技术保密，不愿透露固定相的结构，这对色谱柱和流动相条件的选择产生不便。在这种情况下，使用者必须要求厂家提供固定相的作用模式和固定相的pKa，才能选对混合柱和选择适当的流动相。

注2：如果选择出的混合柱中有两种作用力都很强，有可能产生保留时间太久和峰型不好的问题，除了可以调整流动相的有机相比例或是缓冲液的浓度外，也可以考虑将两种强作用力之一改变，例如反相和阴离子交换作用都太强，除了会造成峰型不好外，也需要使用高浓度的缓冲液和高浓度ACN才能避免保留时间过长，如果遇到这种情形，可以改用反相和阴离子排斥作用的固定相（将两个强作用力之一减弱），可以改善峰形以及缩短出峰时间。

（3）优化流动相的几个基本要素和方法简介

在根据分析物的类型找到适当的混合柱后，接着调整流动相以优化分离效果。影响混合柱分离效果的三个主要的要素是（1）有机溶剂（ACN）的比例，（2）缓冲液的种类和浓度以及（3）pH。

如何调节这三个要素就是成功使用混合柱的关键。这类柱子与常规反相色谱柱最大不同是缓冲液pH的变化不只是会影响可离子化分析物的离子状态，同时也会影响固定相的离子状态。如果不知道固定相的结构，也必须知道固定相的基本作用模式和其pKa，才能了解pH的改变对固定相或是分析物离子化的影响程度。对反相柱而言，如果要增加保留时间，就避免分析物离子化，但是对混合柱而言，如果想要充分利用离子交换作用，就需要调整pH，使得分析物或是固定相呈离子状态。就如同下面的图示，使用混合柱成功的关键就像是细心和耐心的调节三个要素的旋钮，如何调整就必须了解这三个要素会如何影响固定相和分析物。

混合柱固定相和分析物之间的作用力非常多元，包括疏水作用、亲水作用、阳离子交换、阴离子交换、以及阳离子或是阴离子排斥，因此了解如何平衡各种不同的作用力就非常重要：

(A) 了解如何通过改变pH值来改变酸碱性化合物的离子化程度，从而增加或减少离子交换的作用力，或者增加或减少离子排斥作用。可以根据分析物和固定相的pKa，而判断出在某个pH条件下，分析物或是固定相呈现离子还是中性状态（可参阅从pKa到流动相pH的科学选择（二）：缓冲液）。我们可以设置pH梯度, 在分析过程改变离子化合物的电离状态，从而控制其保留时间。例如分析中性和离子化合物时，刚开始可以使用让离子化合物呈现离子状态的pH条件, 保证离子化合物与固定相产生离子交换作用，从而得到较好的保留，当一旦确认中性化合物和离子化合物分离后，可以调整pH梯度逐步减少离子化合物和固定相的离子交换作用（即让离子化合物呈中性状态），而缩短离子化合物出峰时间，因此可以不需要增加缓冲液浓度而得到相同结果。

(B) 了解不同有机相比例对不同电离状态的酸碱化合物和中性化合物保留的影响。例如增加ACN的比例，对于依靠反相来保留的疏水分析物的保留时间就减少（分析物和流动相中的有机相作用力增加，自然减少了分析物和固定相之间的疏水作用）；反之，当减少ACN的比例，就会增加保留时间。但是对于依靠HILIC作用保留对的化合物则刚好相反，增加有机相比例则会增加亲水分析物的保留时间。

(C) 了解使用不同的缓冲液对选择性的影响。例如使用甲酸铵或磷酸氢钠或是其他带有不同反离子（counterions）的缓冲液，对分析物的选择性就不同；同时也需要了解改变缓冲液浓度可以增加或是减少离子化合物的保留时间。如果增加缓冲液的浓度，流动相的离子强度增加，就会增强对依靠离子交换保留的化合物的洗脱能力，保留时间自然就减少。反之，降低缓冲液的浓度就会增加这类分析物的保留时间。

由于混合柱可以在100%的有机或是100%的水相下操作，因此其流动相可操作的范围很广，所以想要充分利用到混合柱的优势，就必须了解如何选择适当的混合柱，然后根据选择的混合柱和分析物的特性来调整不同的参数，从而得到满意的分析结果。以下提供一些案例供参考，以进一步了解如何根据不同分析物种类来筛选适用的混合柱。

a. 分析钠离子和硫酸根离子

化合物种类：（1）钠离子（阳离子），（2）硫酸根离子（阴离子）；

适用混合柱：阳离子交换和阴离子交换（本案例使用Comixsil ACRP 5 u 50×4.6 mm）；

流动相条件：800 mL乙腈+ 200 mL 100 mM pH 3.0 甲酸铵。

b. 分析磷霉素，蔗糖，钠离子和氨丁三醇

化合物种类：（1）磷霉素（亲水，酸性），（2）蔗糖（亲水），（3）钠离子（阳离子），（4）氨丁三醇（亲水性，碱性）；

适用混合柱：HILIC，阳离子交换和阴离子交换（本案例使用Comixsil ACRP 5 u 150×4.6 mm）；

流动相条件：乙腈：200 mM pH 3 甲酸铵 = 75 ：25。

c. 分析甲苯和叠氮离子

化合物种类：（1）甲苯（中性，疏水），（2）叠氮离子（阴离子）；

适用混合柱：反相，阴离子交换（本案例使用Comixsil RP-AX 5 u 150×4.6 mm）；

流动相条件：乙腈：100 mM 乙酸铵（pH 5.4） = 35：65。

d. 快速分析二甲双胍

化合物种类：二甲双胍（极性，碱性）；

适用混合柱：弱反相，阳离子交换（本案例使用Comixshell CARP 2.7 u 100×3.0 mm）；

流动相条件：200 mL乙腈+798.8 mL水+1.2 mL 磷酸。

e. 分析2-萘甲酸

化合物种类：2-萘甲酸（疏水，酸性）；

适用混合柱：反相，阴离子交换（本案例使用Comixshell AIRP 2.7 u 100×3.0 mm）；

流动相条件：乙腈：200 mM 甲酸铵（pH 3） =40：60。

这些案例介绍如何根据分析物的种类来筛选色谱柱，如果有兴趣进一步了解如何选择和优化有机溶剂、缓冲液和pH等以得到满意的分析结果，请在公众号下留言，我们可以提供案例来解析优化过程。

总结：本文的目的是希望拉近色谱分析人员和混合柱的距离，当我们遇到需要同时分析极性差别巨大的化合物或者需要在反相条件下分析无机离子等棘手问题时，可以想起还有“混合柱”这个选择。正如一位资深的色谱分析人员所说，“混合柱，初次使用是惊喜，第二次使用就已经上瘾”。混合模式色谱柱可以在反相柱、正相柱、HILIC柱或是离子交换柱之间自如切换，当我们进入到新奇的混合柱的领域，就可以感受到使用混合柱进行色谱分析既有科学的基础又兼具艺术的美感。混合模式色谱柱——多元的参数操作和调整空间，有力、有趣、有挑战的分析工具。

参考文献

（1） Halfpenny, A. P., Brown, P. R., Mixed-Mode Chromatography via Column Switching for the Simultaneous HPLC Analysis of Ionic and Nonionic Nucleic-Acid Constituents. Chromatographia 1986, 21, 317-320.

（2） Vlad Orlovsky, Yury Zelechonok, Evolution of Mixed-Mode Chromatography, Chromatography, August/Septemer 2011, 24-28.

（3） Elise Lemasson, Sophie Bertin, Philippe Hennig, Eric Lesellier, Caroline West, Mixed-Mode Chromatography – A Review, LC/gc Special Issues, 2017, 30, 22-33.

（4） David Sykora, Pavel Rezanka, Kamil Zaruba, Vladimir Kral, Recent Advances in Mixed-Mode Chromatographic Stationary Phases, Journal of Separation Science, 2019, 42, 89-129.