1五味子甲素、乙素含量测定方法

色谱柱：Kromasil C₁₈柱(4.6mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-乙腈-水(43∶32∶25)；流速：1.0mL·min^-1；检测波长：254 nm；柱温：30℃；进样量：20μL。在此条件下，五味子甲素和五味子乙素两色谱峰理论板数均不小于9500，分离度均大于1.5，拖尾因子均符合要求。

对照品溶液制备取对照品五味子甲素和五味子乙素适量，精密称定，分别用甲醇溶解并稀释制成每1mL中含有五味子甲素0.183mg的对照品储备液和含五味子乙素0.226 mg的对照品储备液；精密吸取五味子甲素对照品储备液1.0mL和五味子乙素对照品储备液2.0 mL，置于10mL量瓶中，加甲醇稀释定容至刻度，摇匀，即得对照品混合溶液。

供试品溶液制备取制得五味子油约0.05g，精密称定，置于10 mL玻璃试管中，加入乙腈(正己烷预饱和)3mL，涡旋混合萃取5 min，4000r·min^-1离心5 min，吸取上清液；下层液再加入乙腈(正己烷预饱和)4mL，涡旋混合萃取5 min，4000r·min^-1离心5 min，吸取上清液。合并两次上清液，转移至50mL量瓶中，以乙腈(正己烷预饱和)定容至刻度，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2 提取工艺因素水平的确定

以五味子油收率、五味子甲素与五味子乙素的含量为指标，选用L₉（3 ⁴）正交试验，结合影响CO₂超临界萃取效率的主要因素，考察萃取压力、温度、CO₂流量的影响，同时考虑生产实际，选取三个水平，见表1。

Tab.1 Design for factors and levels in decoction process

Factors

Levels

Extract press（/MPa）

Temp（℃）

CO₂flow（L·min^-1）

3.5

3超临界萃取正交试验

称取粉碎过二号筛的五味子药材每份250 g，共9份，均匀填满提取罐，按表2-1相应的因素水平进行实验，采用上述的HPLC方法，以五味子油收率、萃取得到的五味子甲素与五味子乙素的含量为评定标准^[19-21]。结果进行方差分析，得出CO₂超临界萃取的最佳工艺。测定结果见表2、3、4、5。

Tab.2 Results of L₉(3⁴) orthogonal experiment

NO	A	B	C	D	Deoxyschizandrin content（%）	γ-Schizandrin content（%）	Oil output （%）
1	1	1	1	1	0.81	0.81	1.07
2	1	2	2	2	0.76	1.16	1.22
3	1	3	3	3	0.83	1.56	8.51
4	2	1	2	3	0.75	1.12	6.64
5	2	2	3	1	0.85	1.83	19.81
6	2	3	1	2	0.79	1.53	4.49
7	3	1	3	2	0.82	1.48	12.87
8	3	2	1	3	0.74	1.42	8.57
9	3	3	2	1	0.70	1.28	7.12
K₁	2.40	2.38	2.34	2.36
K₂	2.39	2.35	2.21	2.37	CT=5.522
K₃	2.26	2.32	2.50	2.32
Ssi	0.0041	0.0006	0.0141	0.00046
K₁	3.53	3.41	3.76	3.92
K₂	4.48	4.41	3.56	4.17		CT=16.51
K₃	4.18	4.37	4.87	4.10
Ssi	0.1572	0.2137	0.3320	0.01108
K₁	10.80	20.58	14.13	28.00
K₂	30.94	29.60	14.98	18.58			CT=549.1
K₃	28.56	20.12	41.19	23.72
Ssi	80.74	19.050	157.8	14.83

Tab.3 Deoxyschizandrin of variance analysis

Source of variation	Sumof squares	Degrees of freedom	Variation	F	Significane
A	0.0041	2	0.0020	8.714
B	0.0006	2	0.0003	1.286
C	0.0141	2	0.0070	30.14	*
Error D	0.0005	2	0.0002

F_1-0.05（2，2）=19.00，F_1-0.01（2，2）=99.00

Tab.4 γ-schizandrin of variance analysis

Source of variation	Sumof squares	Degrees of freedom	Variation	F	Significane
A	0.1572	2	0.0786	14.18
B	0.2137	2	0.1068	19.27	*
C	0.3320	2	0.1660	29.94	*
Error D	0.0111	2	0.0050

F_1-0.05（2，2）=19.00，F_1-0.01（2，2）=99.00

Tab.5 Volatile oil Results of variance analysis

Source of variation	Sumof squares	Degrees of freedom	Variation	F	Significane
A	80.74	2	40.37	5.444
B	19.05	2	9.520	1.284
C	157.8	2	78.88	10.63
Error D	14.83	2	7.415

F_1-0.05（2，2）=19.00，F_1-0.01（2，2）=99.00

4 最佳提取工艺

上述方差分析结果表明，B因素（萃取温度）对提取的五味子油中五味子乙素得率有显著性影响，C因素（CO₂流量）对提取的五味子油中五味子甲素和乙素得率均有显著性影响，结合各因素不同水平相应的Ki值，同时考虑生产实际，确定最佳的CO₂超临界萃取工艺为A₂B₂C₃：萃取压力15MPa，温度41℃，CO₂流量5 L·min^-1。