本次说明是基于核酸适配体能与靶标进行特异性结合的原理，利用流式细胞仪监测适配体与靶细胞的结合状况，还能比较不同适配体与靶细胞之间的结合强度的比较；本次所使用的流式分析仪是BD FACSAria III。

1.原理介绍：

1.1核酸适配体：

核酸适配体(Aptamer，Apt）：是一段寡核苷酸序列（ssDNA或RNA），是利用指数富集的系统进化技术（the Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX）在多样寡核苷酸序列的文库中，进行体外筛选得到。

Aptamer结合靶标原理图

如图所示，在合适的缓冲液环境下，单链寡核苷酸序列具有弯曲以及折叠成特定的三级空间结构的能力，该结构可以与靶分子特异性结合，SELEX技术就是应用该原理来进行选择的。将信息量巨大且随机的的寡核苷酸文库与靶标孵育，经过多轮的优胜劣汰和PCR扩增，最后得到能与靶标高亲和力性结合的寡核苷酸序列，即核酸适配体(Aptamer)。

由于核酸适配体具有靶向特异性的特点，因此应用广泛；那么如何监测适配体靶向细胞亲和力的方法，就需要用到流式细胞术进行表征。

1.2流式细胞仪原理：

流式细胞术能够快速检测细胞或者生物颗粒的特征，其检测灵敏，能够定性或者定量分析颗粒的参数，还具有细胞分选的功能，功能强大，分析参数多，实用性较强。

流式细胞仪（flow cytometer，FCM）的设计应用了光学、细胞化学、电子学等技术，拥有较强大的细胞及微粒分析功能，在临床医学、免疫学、微生物学等等研究领域发挥着巨大的作用。流式分析可以检测细胞表面颗粒复杂程度、核酸以及蛋白质的含量、细胞表面积或者细胞表面的抗体、细胞受体等等，在多种研究领域起到重要作用。

在本研究中应用流式分析细胞荧光强度的基本步骤原理是：

（1）制备成单细胞悬液：将待测细胞预处理进行荧光标记后制成单细胞悬液，通过气压将流式管中的细胞悬液通过管道压进流动室，同时喷出的鞘液将细胞包裹，形成圆形的鞘流，细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过流动室检测区域。

（2）形成光散射：激发光源侧向垂直射向单个细胞，含有荧光的细胞形成两种光：①前向散射光（forward scatter， FSC）：激光束照射细胞时，光束偏移量较小（10°以内），散射至前方，可用于检测细胞等粒子的表面信息，颗粒体积越大，信号越强。②侧向散射光（side scatter，SSC）激光束照射颗粒，产生偏移角度为直角的散射光，可反应细胞内含物的信息。

（3）光信号转化成电信号：光信号导入到计算机中，依次形成电信号，再转化为数字信息。应用FlowJo软件处理数据，可以获得相应的散点图、直方图等形式，便于直观分析。

流式分析基本原理图

2.分析步骤：

2.1细胞预处理：

通过流式分析预处理，可以使细胞在特定的环境，与带有FAM荧光的适配体进行特异性结合，通过平行实验使细胞与不同的适配体文库进行标记，最终表征其荧光强度，进行亲和力的分析与比较。

如表所示，流式分析条件为：

流式细胞分析条件探寻

孵育时条件

孵育时体积

孵育时浓度

细胞浓度单链DNA浓度

第二次洗涤用液

4 ℃，30 min,BB,摇晃

500 μL

2.5×10^6个/mL

125 nM

PBS x 2

流式分析的大致步骤为：消化细胞、细胞与文库孵育、润洗重悬、上样分析。最终确定，初始的细胞悬液浓度为5×106 个/mL，初始文库的浓度为250 nM；孵育时体系的总体积为250 L，细胞浓度为2.5×106个/mL，适配体浓度为125 nM，环境为4 ℃、30 min，震荡。最后上样的细胞悬液体积为500 L，细胞浓度为2.5×106个/mL。

2.1.1材料准备：

流式分析主要仪器与试剂

名称	规格/型号	作用
流式细胞仪	FACSAria III	对细胞进行流式分析
可调式混匀仪	MX-S	混悬适配体悬液
震荡仪	MX-M	震荡孵育体系，防止细胞贴壁
制冷恒温金属浴	HX-20L	热击适配体，使核酸变性恢复到自由的无规则卷曲状态
显微镜	DMI1	观察细胞
水浴氮吹仪	FY-DCY12S	加热试剂
电子天平	JA2003	称量药品
离心管	15 mL×10、50mL×10	分装试剂，装载需离心的细胞
低吸附离心管	2 mL×20	装适配体悬液，减少适配体与细胞在管壁上的吸附
一次性使用吸管	3 mL×20	方便地吸取PBS
细胞刮刀	3010×1	刮下贴壁生长的细胞
PBS	50 mL×2	ScienCell
Cell Dissociation Solution	100 mL	消化细胞
0.25%Trypsin-EDTA	100 mL	Gibco
1×PBS缓冲液	500 mL	润洗细胞，重悬细胞
Cell Dissociation Solution	100 mL	消化细胞
0.25%Trypsin-EDTA	100 mL	Gibco
1×PBS缓冲液	500 mL	润洗细胞，重悬细胞
无酶无菌水	500 mL	溶解适配体文库
DMEM高糖培养基	50 mL	停止消化
细胞	＞5×106个	作为目的细胞进行流式表征

①配置Binding buffer（结合缓冲液BB）：配置10 g/L BSA：称量0.1g BSA，溶于10 mL Washing Buffer，过膜；取上述溶液5 mL，加入到445 mL Washing Buffer中；再加入500 L鲑精DNA，混匀。

②将U盘格式化，提前打开制冰机和金属浴（95℃）；

③37℃水浴：将无酶消化液、ECM、PBS（1）放入37℃水浴。

④4℃冰敷：向泡沫盒中加碎冰，离心管架、温度计，准备4℃孵育环境，放入PBS和BB预冷。

⑤打开显微镜（酒精擦拭载物台）。

⑥打开离心机：120 g，1 min，25℃。

2.1.2计数和文库预处理

（1）细胞计数（20倍或者40倍显微镜）：

①采用直接计数法，在显微镜中随机选择五个点进行计数取平均值，根据视野的面积以及T75培养瓶面积计算细胞总数，推出公式：Y为总细胞数；X为视野中细胞平均数；Y=27886.12X（20倍镜下）/Y=111111.11X（40倍镜下)。为了保证流式有足够的细胞，需要保证细胞总数＞5×106个/mL。

②计算BB体积：V=Y/（2×107）mL，用V体积的BB重悬细胞沉淀，可获得细胞浓度为5×106个/mL的初始细胞悬液。

（2）文库预处理：

①将粉末状适配体文库进行离心：4000 r，5 min，4℃；使适配体粉末聚集在离心管底部，防止打开离心管时干粉状适配体飞出。

②按照说明用一定体积的无酶无菌水溶解适配体，使适配体母液浓度在5 M。

③取100 L母液，并加入900 LBB，使适配体浓度在500 nM。

④再去上述液体500 L，并用BB稀释至浓度为250 nM，最终得到250 nM的适配体文库悬液。

⑤95℃热击3 min，热击后放在泡沫盒中冰敷。

2.1.3细胞处理

（1）消化：

①PBS（37℃）润洗3次。

②无酶消化液3 mL，消化9 min（等待期间准备好孵育用离心管；确认离心机参数为：120 rcf，1 min，25 ℃），吹打细胞使其从培养瓶表面脱落。直接转移至15mL离心管中，吹打混匀约20次（吹散细胞团，分离成单个细胞）。

③显微镜观察确认细胞均从培养瓶上脱落，加入2-3 mL ECM至培养瓶中润洗，然后转移至上述离心管中，吹打终止消化。

④离心：120 rcf，1 min，25℃。（等待期间各加入250 L待测文库至低吸附离心管中,注意要快速，吸取之前需要先混悬文库）。

⑤离心之后小心倒出，用枪吸出剩下的ECM，加入2V L BB，重悬吸打混匀，获得5×106个/mL的细胞悬液。

2.1.4细胞与文库结合

①孵育：分别加入250 μL上述细胞悬液至250 μL ssDNA文库中，进行孵育：4℃，30 min，打开摇床第二格。

②等待期间离心机调至4℃；用密封袋装好洁净的1000 L枪头准备流式上样用；2.2.2.5 润洗重悬细胞

①取出孵育好的体系，进行离心：4℃，120 g，1 min（等待期间准备好4℃ PBS)。

②倒掉上清液，用枪头小心吸出管口残留的上清液，每管加500 L PBS（4℃）用移液枪吸打重悬约20次。

③再次离心4℃，120 g，1 min。

④第二次重悬：重复①-③步骤。

⑤每管加入500 L PBS重悬，忽略实验损失，最后得到理论细胞浓度为2.5×106个/mL的细胞悬液。

2.2送样分析

FAM荧光染色较弱，在预处理之后应尽快进行流式分析，流式分析上样程序复杂，需要正确进行开机，测样，关机的步骤，才能够得到准确的数据。

（1）准备工作：

准备1000 mL移液枪，1000 mL 洁净枪头，流式管，质控微球。

①开启液流系统：由上至下打开流式细胞仪开关；再开启计算机，打开FACSDiva软件，在“Cytometer仪器框”中确认流式细胞仪已与电脑连接，启动液流之前，确认液流系统水平，进行补充鞘液、去离子水、乙醇以及漂水，并清空废液。

在“Cytometer”菜单中，点击“Fluidics Startup（启动液流系统）”，按照提示进行操作：确定气路和液路是从乙醇桶连接到了鞘液桶上：将蓝色液路管接到过滤器下方，透明气路管接到鞘液桶上；确定闭合的喷嘴是在流动检测池上。

②将70 m的喷嘴放入装有超纯水的烧杯中，超声30 s，用无尘纸蘸干；抽出闭合的喷嘴；插入70 m的喷嘴（红圈朝上）。

③点击“×steam”，开启液流，出现水滴状，调整使上端横线位于第二个或者第三个水滴的尾部，下端横线位于第三个或者第四个液滴的中部，调整好后关闭液流。

（2）做质控：

①用CS&T微球，用之前一定将微球甩匀（保证取出的微球呈均匀体系）用涡旋震荡；取一支洁净的流式管加入333 L的鞘液，再加一滴微球（用之前用混悬仪混匀，正常的微球为浑浊状）。

②打开液流系统，在“Cytometer”菜单下点击“CST”；展开Setup Control窗口：在Characterize菜单中中选择“Check Performence”；在Configuration流式设置中：喷嘴的大小：选择70m，点击左下角“set configuration”，再点击“OK”。

③选择微球的Lot ID：与微球瓶身上编号对应：10549。

④敲弹准备好的微球悬液使其混匀，进行上样，打开液流；确认激发光源没问题即可关掉页面并关掉液流。

（3）上样：

①新建样品，并勾选FITC、SSC、FSC的H、A、W、log数据项。

②作图：建立散点图，横坐标为FSC-H，纵坐标为SSC-H；再建立一个图：横坐标：FITC-H，纵坐标为：Count。

③打开液流至3，选择对应样品；吹打混匀并放置样品，点击“LOAD”上样。调整FSC和SSC的电压，使散点图的中的点都集中在所圈的门中。（若散点偏右，则FSC电压过大，调整FSC电压使其变小，若散点偏上，则调整SSC使其变小。）当调整合适时点击“RECORD”记录数据。

④计数完毕，调低流速，点击“unload”，选择第二个样品并重复第③步。

⑤上样完毕之后，保存数据。

（4）关机步骤：

①上一管clean液，高速冲2 min；再上一管去离子水，高速冲5 min；关闭液流，检查液路系统。

②在“Cytometer”菜单中，选择“shutdown”，根据指示操作：取下70 m的喷嘴，超声清洗，安装闭合喷嘴（红色点朝上）。

③把液路和气路连接到乙醇桶上，用乙醇冲洗（先拔气路再拔液路）。

④装一管clean液，清洗上样针和流动池。

完成上述步骤之后即可关闭界面。

2.3数据处理：

将原始数据用Flowjo软件进行处理，得到散点图以及荧光强度直方图，接下来通过举例来说明数据如何分析：

（1）散点图分析：

数据处理分析散点图

该图为散点图，可以看出大体分为两个集团，散点图有两个集团说明体系中有两种细胞粒子，并且在该图片的左下角粒子较少，说明细胞碎片较少，在预处理时较好地保护了细胞的完整性。

散点图中可以区分出整个上样的体系中主要含有两种大小的细胞颗粒，在预处理的过程中，无酶消化液的消化能力较弱，并且细胞团密度较大，细胞间黏连较多，在最后孵育结束用PBS进行重悬的时候仍然能够肉眼可见有白色细微絮状物。FSC值越大，代表颗粒的体积越大；SSC值越大，代表颗粒内部的复杂程度越高。故可初步判断，G1门中的颗粒为未消化完全的细胞团，而G2门中的颗粒为分散的单个细胞。

（2）直方图分析：

数据处理分析直方图

图中为G2门选中的样品的荧光强度，该图中有两个峰，横坐标102附近所产生的荧光峰可以判定是残留的细胞碎片，可视为背景值，横坐标104~105附近的峰代表四个适配体分别与细胞结合所产生的荧光强度，SYL3C-Aptamer结合偏移量最大，荧光较强，且高荧光事件次数较多，说明SYL3C-Aptamer与单个细胞的结合能力最强，并且G2门中的颗粒大多数为消化完全的单个细胞，呈现出较好的特异性。

总之，该组结果对比体现出，单个细胞靶点较多，适配体与单个细胞结合能力较高，通过荧光强度波峰的偏移所反映的适配体与细胞特异性结合能力的大小依次为SYL3C-Aptamer＞EP166-Aptamer＞CA2-Aptamer＞ARC1172-Aptamer。

同时，由图中可以看出：10th-ssDNA pool与SYL3C-Aptamer在104～105荧光强度波峰较高，说明二者与单个细胞的结合能力较好，结合位点较多，呈现良好的特异性和亲和性。SYL3-Aptamer荧光波峰明显右移，与单个细胞的结合位点较多。

三、总结

本次说明旨在利用带荧光的适配体靶向特异性结合目的细胞的原理，利用流式细胞仪监测适配体结合靶细胞能力的强弱，同时还可以应用于不同适配体靶向同一种细胞的结合能力强弱的比较。进一步利用流式细胞仪，还可以测定适配体的Kd值；还可以根据预处理的条件不同，与对照组比较，来测定适配体靶向细胞的受体是位于细胞膜表面还是细胞内，从而进一步测定适配体的生物学稳定性。

同时，流式细胞仪还有很多方面的应用，例如鉴定细菌、检测细胞凋亡等，一些抗体-细胞复合物的结合情况也能够由流式细胞仪来进行监测。

在进行流式上样的过程中，预处理、上样以及数据处理阶段都有需要注意的细节，例如：本次所使用的细胞为贴壁生长的内皮细胞，故在细胞预处理时需要先消化细胞；在进行上样前，需要将样品进行吸打混匀，以免细胞沉积在流式管底部，导致未吸取到样品；在应用流式细胞仪的过程中，使用前的维护、质控流程十分重要，该流程会直接影响所得数据的稳定性；不同的流式细胞仪的维护程序稍有不同，本次说明中的使用方法只适用于BD FACSAria III，流式细胞仪具有强大的分析功能，其在细胞研究中具有重要的作用。