主题:【第十届原创】保健品中粗多糖含量的测定

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段科
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保健品中粗多糖含量的测定



本文研究了苯酚-硫酸法检测不同基质的保健品中粗多糖的含量,论述了不同基质的前处理方法和经验。
1      前言
市场上常见的保健品多种多样,胶囊、口服液、药片等等。多糖含量作为保健品中的有效成分之一,越来越引起人们的关注。从药理学上讲,多糖具有抗肿瘤、抗病毒、增强免疫力、抗氧化、抗心血管疾病等。因为具有诸多功效,许多保健品生产公司也开发越来越多的含多糖保健品,通过在保健品中添加含有多糖的中药材或者海洋生物,从而使该保健品具有较高的多糖含量,增强其功效。不仅在胶囊、口服液等常规的保健品中添加含有多糖的成分,甚至在一些咖啡、饮料、食品中也添加含有多糖的组分,使其成为功能性的产品。
多糖的含量对其功效的发挥至关重要,那么怎么准确、有效地检测出保健品中多糖的含量是一个重要的环节。保健品由于种类繁多,基质复杂,找到一种简单、有效的检测方法,能够检测出各种基质的保健品中多糖的含量具有重要的意义。
本实验中采用了常见的苯酚-硫酸法检测保健品中粗多糖含量,选用乙醇提取以除去单糖、低聚糖、甙类及生物碱等干扰成分,然后用去离子水提取其中所含的多糖类成分。多糖在硫酸作用下,水解成单糖,并迅速生成糖醛衍生物与苯酚综合成有色化合物,用分光光度法测定其多糖含量。
2  实验部分
2.1 试剂
95%乙醇;                                             
葡萄糖:优级纯;
葡萄糖标准液:精确称取105℃干燥恒重的葡萄糖100 mg,置100 ml容量瓶中,加蒸馏水溶液解并稀释至刻度(可加几滴甲苯或几粒苯甲酸防腐)。此标准溶液1.00 ml含葡萄糖1.00 mg,储存于冰箱冷藏;
苯酚;
苯酚液:称取优级纯苯酚10.0 g,加水150 g ,置棕色瓶中备用,储存于冰箱;
浓硫酸。
2.2  仪器
分光光度计。
2.3  分析步骤
2.3.1 样品预处理
(1) 口服液等液体样品
准确移取2.00~10.00 mL液体口服液试样,置于250 mL圆底烧瓶中,加入9倍体积的95%乙醇,混匀,静置1 h,回流提取1 h,趁热过滤,残渣用95%乙醇5 ml洗涤三次。将残渣连同滤纸置于烧瓶中,加蒸馏水50 mL,在60℃水浴中加热提取30 min,趁热过滤,残渣用5 mL热水洗涤三次,洗液并入滤液,放冷后移至100 mL容量瓶中,稀释至刻度,备用。
(2)内容物为膏状的胶囊样品或者膏状类样品
准确称取0.50~1.00 g膏状内容物或膏状样品,倘若其中含有油脂类辅料,加入乙醚或者石油醚脱脂,离心,弃去乙醚或者石油醚层。再用一定体积的水溶解,转移至250 mL圆底烧瓶中,加入9倍体积的95%乙醇,混匀,静置1 h,回流提取1 h,趁热过滤,残渣用95%乙醇5 ml洗涤三次。将残渣连同滤纸置于烧瓶中,加蒸馏水50 mL,在60℃水浴中加热提取30 min,趁热过滤,残渣用5 mL热水洗涤三次,洗液并入滤液,放冷后移至100 mL容量瓶中,稀释至刻度,备用。
(3)内容物为粉状的胶囊样品或者粉状片剂、咖啡等
准确称取0.10~0.50 g均质后的粉状样品,倘若其中含有脂肪类辅料,先加入一定体积的水,溶解粉状样品,再加入乙醚或者石油醚脱脂,离心,弃去乙醚或者石油醚层。将水层转移至250 mL圆底烧瓶中,加入9倍体积的95%乙醇,混匀,静置1 h,回流提取1 h,趁热过滤,残渣用95%乙醇5 ml洗涤三次。将残渣连同滤纸置于烧瓶中,加蒸馏水50 mL,在60℃水浴中加热提取30 min,趁热过滤,残渣用5 mL热水洗涤三次,洗液并入滤液,放冷后移至100 mL容量瓶中,稀释至刻度,备用。
2.3.2 标准曲线的制备
吸取葡萄糖标准液0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL,分别置于50 mL容量瓶中,加水定容。吸取上述溶液各2.00 mL,再加苯酚液1.00 mL,涡旋混合均匀,迅速沿管壁加入浓硫酸5.00 mL,摇晃后涡旋混合,放置5 min,置沸水浴中加热15 min,取出后冷却至室温,于490 nm处以水代替样品作参比测吸光度,绘制标准曲线。
2.3.3 样品中多糖含量测定
吸取2.00 mL样品液,置于10 ml容量瓶中,加水定容。吸取2.00 mL上述溶液,按标准曲线制备项下方法测定吸光度。另以2.00 mL水,同上操作做空白。查标准曲线得样品液中葡萄糖含量。
2.3.4 液体样品分析结果的计算
计算液体样品中酸性多糖的含量按式(1)或者(2)计算,分别以mg/mL或者mg/g表示。
 
式中:                                           
X—保健品中酸性多糖含量(以葡萄糖计), mg/g或者mg/mL表示;
A—从浓度-吸光度曲线上查得样品溶液的葡萄糖浓度,μg;
B—从浓度-吸光度曲线上查得空白溶液的葡萄糖浓度,μg;
V1—多糖溶液总体积,mL,如按本方法为100 mL;
V2—移取多糖溶液的初始体积,mL,如按本方法为2 mL;
V3—待测多糖浓度溶液的总体积,mL,如按本方法为10 mL;
V4—待测多糖溶液的移取体积,mL,如按本方法为2 mL;
m—保健品的称取质量,g;
V0—保健品的测试体积,mL;
如两次测定符合允许差时,取两次测定结果的算术平均值作为结果,报告结果取三位有效数字。
2.3.5  允许差
同一样品的两次测定值之差不得超过两次测定平均值的10%。
2.3.6 结果与分析
(1)含油脂类样品脱脂与否的影响
含有油脂类的保健品,脱脂前后采用上述方法进行酸性多糖含量测定时,多糖含量有一定的差别,未脱脂的样品进行多糖含量测定时,过滤过程十分缓慢,耗时长,多糖含量数据经常不平行,而且数值偏高。


图1 乙醚脱脂



样品经过乙醚脱脂后有明显的油脂层。


图2 回流后的未脱脂样品



图3 回流后的脱脂样品



通过比较图2和图3,脱脂后的样品溶液更加澄清,无论是过滤还是洗涤,反应更快速,洗涤效果也更好。相反,未脱脂的样品,整个容器壁上都黏附着脂肪、油脂层,即使离心后过滤,过滤速率也很差,滤液也很浑浊,如下图4所示。



图4 脱脂前后滤液的比较

没有脱脂的样品,油脂层包裹着含有单糖或者寡糖的乙醇溶液,不容易被乙醇洗涤干净,这部分残留的单糖或者寡糖导致结果偏高。因此,对相应的含油脂保健品提前进行脱脂后再检测多糖,不仅能减少操作的时间,还能获得更为准确的结果。

(2)醇沉时间的影响

对以含有大豆油辅料的胶囊内容物进行脱脂后沉淀粗多糖,对比了加入9倍95%乙醇后立即回流提取多糖和加入9倍95%乙醇后室温下静置1 h再回流提取多糖,结果显示,加入乙醇后立即回流提取多糖与静置1h后再回流检测出的多糖含量分别为41.69 mg/g、48.08mg/g。可以看出,室温下醇沉时间的增加可以使更多的粗多糖醇沉完全,检测含量增高。

(3) 苯酚硫酸法操作方法的影响

苯酚硫酸法检测粗多糖含量最为常见,操作简单,适用于常规检测。在实验过程中发现,无论苯酚和浓硫酸的加入比例是1:5还是1:10,苯酚的体积分数是5%还是6%,在进行加入时最好是一个样品加完苯酚,混匀后,立即沿管壁加入浓硫酸,混匀后,再加另一个样品的苯酚和浓硫酸,这样显色更稳定。实验中发现,倘若对所有样品全加完苯酚混匀后,再统一加浓硫酸,显色及不稳定,标准曲线甚至不成线性。苯酚易挥发,长时间与空气接触也容易被氧化,造成结果不稳定。


图 5 苯酚-硫酸法检测多糖含量

图5为苯酚硫酸法侧多糖含量的标准曲线和样品,采用了单个样品加完苯酚和浓硫酸后再加另一个样品的苯酚好浓硫酸,显色稳定有规律,经过分光光度计检测,线性良好,样品数据平行,能够有效避免苯酚-硫酸法重现性差这一缺点。



3. 结论
采用苯酚-硫酸法检测保健品中粗多糖含量时,针对各种基质进行相应的脱脂操作、增加回流前的醇沉时间、进行显色反应时加入苯酚后混匀立即加入浓硫酸,能够使检测的数据更可靠、稳定。
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段科
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原文由 Kevin(m3163882) 发表:
您上传的图片有点问题 请再编辑一下
好了版主
vivi
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指出了多处需注意的细节,值得学习,赞
yy_0324
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快乐
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zyl3367898
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一个试验这么多注意点,楼主下了一番功夫,赞。
月亮下的猫
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谢谢你给我提供一个思路,我也在为工作曲线线性不佳找原因