主题：【第十一届原创】茶叶中咖啡因对有机磷类农药残留测定的影响

                                                      茶叶中咖啡因对有机磷类农药残留测定的影响
摘要：茶叶中经常要检测有机磷类农药（甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧乐果、毒死蜱、马拉硫磷、杀螟硫磷），由于茶叶样品基质富含咖啡因的特殊性，本文主要阐述了用气相色谱法测定茶叶中这些有机磷时，咖啡因对这些农药测定的影响，及如何准确地测定这些有机磷农药残留。
关键词：茶叶；咖啡因；有机磷农药；气相色谱法；准确定量
前言：茶叶是深受人们喜爱的一种饮料这一，最近来，滥用农药的现象也越来越严重，GB 2763-2016也对茶叶中各种农药残留的限量作了具体的规定。众所周知，茶叶富含芳香族化合物、多酚和咖啡因。咖啡因等化合物会在前处理的萃取过程中与农药残留一起被萃取出来，如果没有有效地去除，将会对目标农药（毒死蜱、马拉硫磷、杀螟硫磷）的准确定量造成影响，同时有机磷类农药（甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧乐果、毒死蜱、马拉硫磷、杀螟硫磷）用气相色谱分析时通常会一起进行净化前处理，一起上机用FPD检测器上机分析。这又给部分农药残留（甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧乐果）的准确定量造成了失误。
实验仪器：岛津gc -2010plus(配FPD)； 色谱柱：RTX-170130m*0.25mm，0.25um

仪器条件：进样口温度：220 ℃ 检测器温度：230 ℃

程序升温：60℃（1 min）^20℃/min 150℃ ^15℃/min  230℃  ^25℃/min  280℃（5 min）
标准品：甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧乐果、毒死蜱、马拉硫磷、杀螟硫磷、咖啡因
样品处理（方法一）：依SN/T1950-2007对茶叶进行处理，同时进行加标实验。
提取：取样1.0g（±0.01g）于50mL塑料离心管中，加入1mL饱和氯化钠水溶液浸泡十分钟左右，加入15mL乙酸乙酯先均质，再加入一勺无水硫酸钠和2勺无水硫酸镁均质30s，用15mL乙酸乙酯洗均质头合并提取液，盖上盖子振摇一会，超声5min。把提取液和残渣一起直接过加有2勺无水硫酸镁的漏斗入鸡心瓶中，2×5mL乙酸乙酯洗离心管，振摇，合并提取液于鸡心瓶中。再用20mL乙酸乙酯冲洗漏斗上的残渣合并洗液，35℃旋转蒸发至剩2mL左右，待净化。
净化：10mL丙酮+正己烷（1+1, V+V）先活化TPT（10mL,2g）柱子（填料上加1cm左右高的无水硫酸钠）下接15mL玻璃离心管，将上述大约剩2mL左右的乙酸乙酯先吸出直接过活化后的TPT柱，再用丙酮+正己烷（1+1, V+V）2.5 mL×2次洗涤鸡心瓶（必要时超声波），洗液继续过TPT柱子，加丙酮+正己烷（1+1, V+V）继续淋洗柱子共收集12mL淋洗液，35℃左右氮气吹干，丙酮+正己烷（1+1, V+V）定容1mL上机测试。

混标（甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧乐果、毒死蜱、马拉硫磷、杀螟硫磷）与茶叶基质堆栈色谱图，如图1所示：

从图1中可以看出：茶叶基质（空白茶叶）在毒死蜱、马拉硫磷、杀螟硫磷出峰位置附近出现很大的坡（后经确认是茶叶基质中的咖啡因：前处理浓缩定容时会产生白色絮状物，此白色絮状物就是茶叶基质中的咖啡因析出产生的），给茶叶中毒死蜱、马拉硫磷、杀螟硫磷准确定量带来了严重影响。且气相进了茶叶基质中的咖啡因后，要连续进十几针的丙酮空白针，此坡才能消失，才不会对后续的出峰位置的物质定量产生干扰。
样品处理（方法二）：（目标：要去除茶叶基质中的咖咖啡因。）

提取：取样2.0g（±0.01g）于50mL塑料离心管中，加入2mL去离子水、20mL丙酮+正己烷(1+1，V+V)溶液和一勺无水硫酸钠，旋紧离心管盖，涡旋1min后超声30min，超声期间每5min振摇一次，4000 r/min离心5min，待净化。

净化： 移取5.0mL上清液至15mL离心管中，35℃下氮气吹干，加入2.5mL正己烷涡旋使样品溶解，再加入2.5mL饱和氯化钠水溶液继续涡旋30s说明：用饱和氯化钠水溶液和正己烷分配可去除水溶性杂质及咖啡因）后2000 r/min离心1min，取出正己烷层，剩余溶液中加入2.5mL正己烷再提出一次。合并正己烷层过经5mL丙酮+正己烷(1+1，V+V)活化上填1cm高无水硫酸钠的Carb/PSA柱(0.5g/ 6mL)，用8mL丙酮+正己烷(1+1，V+V)继续洗脱，共收集洗脱液13mL于15mL刻度玻璃离心管中，35℃水浴氮气吹干，用正己烷定容1mL上gc-FPD检测。同时进行加标处理（加标量：加入200ng/mL的有机磷混标1mL，与样品同时同样处理，相当于最终上机浓度为40ng/mL）。从图1中可以看出：茶叶基质（空白茶叶）在毒死蜱、马拉硫磷、杀螟硫磷出峰位置附近出现很大的坡（后经确认是茶叶基质中的咖啡因：前处理浓缩定容时会产生白色絮状物，此白色絮状物就是茶叶基质中的咖啡因析出产生的），给茶叶中毒死蜱、马拉硫磷、杀螟硫磷准确定量带来了严重影响。且气相进了茶叶基质中的咖啡因后，要连续进十几针的丙酮空白针，此坡才能消失，才不会对后续的该出峰位置附近的物质定量产生干扰。


                                表1  用方法二处理各有机磷的回收率
从图2及表1可以看出：使用方法二处理（用饱和氯化钠水溶液和正己烷分配可去除水溶性杂质及咖啡因：茶叶样品基质中的咖啡因大谷峰已消失）毒死蜱、马拉硫磷、杀螟硫磷可以准确地给予定量了，然而甲胺磷、乙酰甲胺、氧乐果却也同时会与咖啡因从正己烷层进入饱和的氯化钠层而被洗脱除去。因此用方法二来处理茶叶基质的方法可以很好地去除咖啡因基质，适用于检测毒死蜱、马拉硫磷、杀螟硫磷，不适用于同时要检测：甲胺磷、乙酰甲胺、氧乐果这三种有机磷的净化方法。
（必要时）样品处理（方法三）：适用于茶叶中甲胺磷，乙酰甲胺磷的净化方法。
取干样0.5g于50mL塑料离心管中加2mL水，放置至少30分钟。加入20mL乙酸乙酯和10g无水硫酸钠，均质0.5min，用10mL乙酸乙酯清洗均质头，合并提取液4000r/min离心5分钟，上清液经装有10g无水硫酸钠的漏斗脱水于鸡心瓶中，残渣再用20mL乙酸乙酯涡漩洗涤，4000r/min离心5分钟，上清液并入鸡心瓶中，再用10mL乙酸乙酯冲洗漏斗上的残渣合并洗液35℃浓缩至干。
净化：用乙酸乙酯2mL×3次漩涡振荡洗涤鸡心瓶，过经5 mL乙酸乙酯活化过的上填1cm高无水硫酸钠的硅胶柱（LC-Si0.5g / 6mL硅胶固相萃取小柱），待洗涤液流完接近硅胶柱中无水硫酸钠顶端时，再用乙酸乙酯洗, 弃去前9 mL洗液，继续用乙酸乙酯洗并收集15mL于15mL刻度玻璃离心管中，35℃水浴氮气吹干，用1mL乙酸乙酯(色谱纯)定容，上机测试。
说明：

1）提取剂乙酸乙酯极性较强，能有效地将食品中的甲胺磷提取出来，且样品基质中的共提取杂质相对较少；使用乙腈提取时共提取杂质稍多。使用无水硫酸钠一方面配合均质器研磨，增加分散的均匀度，加强溶剂与样品的接触，提高提取效率，另一方面可以将样品中的水分以结晶水的方式除去，既不对甲胺磷产生吸附，又避免甲胺磷溶于水导致回收率的损失。配合超声波辅助提取，进一步提高提取效率。实验时需先加乙酸乙酯后加无水硫酸钠，以免无水硫酸钠结块导致均质困难。由于本实验对水分的残留较为敏感，提取时要尽可能将水分除干净，否则影响刭PSA填料的吸附性能，净化效果变差； 影响到Lc—si柱的吸附性能，可能改变柱上的洗脱规律，甚至导致实验的失败。可将无水硫酸钠在 650℃焙烧约4 h后备用，必要时增加用量。

作用机理研究： LC—Si柱／乙酸乙酯选择洗脱净化是本前处理方法的核心步骤。Lc-Si柱是经典的正相同相萃取柱，基于正相原理使杂质吸附于柱上，目标化合物随溶剂洗出，一般使用中等偏弱极性的溶剂洗脱。乙酸乙酯是极性较强的溶剂，在这种介质中，大量中强极性及弱极性杂质均难以保留而与目标化合物一起洗出，导致净化步骤失效。本实验正利用了在乙酸乙酯介质中大量杂质均难以保留的特点，使其先于甲胺磷流出LC—Si柱，然后甲胺磷在特定阶段流出再与仍然吸附于柱上的强极性杂质分离，达到了良好的净化效果。
此法适用于各种复杂基质中的甲胺磷、乙酰甲胺磷的检测（如果没有经过LC—Si柱净化处理且洗脱液的前9mL洗脱液要弃去，有的样品基质会再甲胺磷、乙酰甲胺磷的出峰位置如茶叶基质中的咖啡因一样出现很大的坡峰，给甲胺磷、乙酰甲胺磷的定量造成干扰）净化处理。
结论：
综合所述：茶叶中甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧乐果、毒死蜱、马拉硫磷、杀螟硫磷中有机磷的检测要分成两种不同的净化方法进行处理。
样品处理（方法一）适用于茶叶中甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧乐果的净化处理方法，因为此种净化处理方法会同时萃取出茶叶基质中的咖啡因，茶叶富含咖啡因基质，在气相中难以消除，会给在咖啡因出峰位置相近的化合物的定量产生干扰（如：毒死蜱、马拉硫磷、杀螟硫磷等）
样品处理（方法二）适用于茶叶中毒死蜱、马拉硫磷、杀螟硫磷的测定，如果茶叶样品没有检测甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧乐果时，尽量采用此种的净化处理方法，茶叶中的咖啡因用饱和氯化钠水溶液和正己烷液液分配处理后，水溶性杂质、咖啡因及农药（甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧乐果、久效磷）会进入饱和氯化钠水溶液层，而其它的农药则留在正己烷层，茶叶样品基质中的咖啡因大谷峰已消失。
样品处理（方法三）是遇到个别复杂基质（如有次我们要检测到含茶制品：速溶麦香红茶）时，必要时采用的净化处理方法，过硅胶柱（LC-Si柱）用乙酸乙酯洗脱且弃去前9mL洗脱，收集后面的15mL左右的洗脱液可保证基质中的杂质在前面9mL时洗出弃去，而目标物（甲胺磷、乙酰甲胺磷）被准确定量地收集到。