摘要：基于在线湍流固相萃取-高效液相-串联质谱(on-lineTurboflow-SPE-HP$$lc-MS/MS)，建立了一种用于全自动快速检测尿液中43种全氟及多氟类化合物的方法。依次对液相参数、湍流柱、进样体积、负载流速和时间以及洗脱时间进行了优化，并结合内标法对基质效应进行了校正。25μL尿液样品实现了直接、快速检测。所有目标化合物在0.05-50ng mL^-1范围内呈现良好线性关系(r² >0.99)，检测限在0.008~0.19ng mL^-1 之间。方法具有良好的加标回收率（86%~109%）和精密度（日内：1.7~9.2%，日间：1.3~11.5%）。与现有文献比较，本方法在短链（碳链长度小于6）和长链（碳链长度大于12）PFASs的检测中表现出更低的检出限和更优的回收率。将方法用于检测30个人体尿液样品，PFBA和PFBS是最主要的两种检出物，浓度范围分别为<LOD至128ng mL^-1，<LOD至548ng mL^-1。本方法极大地减少了人工操作，缩短了测样时间，降低了溶剂用量，并且灵敏度高、操作简单，在大批量准确、快速检测尿液中痕量PFASs的研究中具有良好的应用前景。
关键词：全氟及多氟类化合物；湍流色谱柱；在线固相萃取；人体尿液

1. 引言
全氟及多氟化合物（per-and polyfluorinated alkyl substance，PFAS）具有独特的物理化学性质，被广泛应用于工业生产和社会生活的各个领域。全氟辛烷磺酸（PFOS）和全氟辛酸（PFOA）是两种最主要的传统PFASs，2009年PFOS已经作为持久性有机污染物（POPs）被列入斯德哥尔摩公约，2015年PFOA也作为候选物质被列入审查名单中，目前PFOS和PFOA的生产使用已经在一些国家和地区受到管制。近年来，较短链PFASs（如PFBA、PFBS），氯化聚氟醚磺酸盐（Cl-PFESA）等化合物作为传统PFASs的替代品已被应用于工业生产中，并已在环境介质和人体中检测到，其中一些PFASs甚至呈现出大规模增长趋势。同时，在评估人体PFASs的总暴露量时，还应考虑PFASs前驱体。有研究报道，如FTOH、monoPAPs、diPAPs、PFPAs、PFPiAs和FTSAs等前驱体类化合物，可通过生物降解成PFCAs，FOSA和FOSAAs亦可通过生物转化为PFOS。虽然前驱体类化合物的代谢与人体中PFASs总体负荷密切相关，对于人体赋存的检测基质，血液属于损伤性基质，不易获取，而尿液相对来说较易获得。研究表明，血液和尿液中PFASs存在相关性，因此，尿液可以当做PFASs的有效基质。目前关于尿液中PFASs的广谱快速检测的相关研究还较少，在线湍流固相萃取-高效液相色谱-串联质谱联用（on-lineTurboFlow SPE-HP$$lc-MS/MS）技术是一种快速检测复杂基质中污染物的新型方法，已被广泛应用于血液、尿液和水体中小分子的检测。本研究开发一种前处理简单、灵敏度高、并可同时检测人体尿液中PFASs及其前驱体类化合物的分析检测方法。
2．实验部分
2.1材料和仪器
本研究使用的所有天然和同位素标记的PFAS标准品（表1）均购置于惠灵顿实验室（Guelph,Ontario, Canada），所有标准品的纯度均超过98%。乙腈（ACN），甲醇（MeOH）和异丙醇（IPA）均为$$lc-MS级溶剂（ThermoFisherScientific，USA）。醋酸铵（NH4OAc），（> 97%），氢氧化铵（28%），乙酸（>99.8%，HP$$lc级），甲酸（>98%，HP$$lc级）和1-甲基哌啶（1-MP，>98%）购置于自Alfa Aesar公司（WardHill，MA，USA）。本研究使用的超纯水（>18.2MΩcm）取自Milli-Q Advantage A10系统（Millipore，USA）。液相色谱仪为UltiMate™3000（ThermoFisherScientific，USA），由DG$$lc-3600RS双梯度快速分离泵，WPS-3000 TLS自动采样器和带有六通（2P-6P）阀门的TCC-3200柱温箱组成，质谱检测仪为ThermoQuantiva 三重四极杆质谱仪（ThermoFisherScientific，USA）。整个分析过程由Chromeleon6.70色谱工作站控制，数据由Xcalibur 3.0软件记录。

表1. PFASs的检测参数（加粗代表定量离子）

化合物	母离子 (m/z)	子离子(m/z)	碰撞能(V)	RF Lens (V)	内标物
FTSAs
4:2 FTSA	327	81，307	29	82	¹³C₂-4:2 FTSA
6:2 FTSA	427	81，407	24	91	¹³C₂-6:2 FTSA
8:2 FTSA	527	81，507	26	113	¹³C₂-8:2 FTSA
10:2 FTSA	627	81，607	30	141	¹³C₂-8:2 FTSA
monoPAPs
6:2 monoPAP	443	79，97	41	61	¹³C₂-6:2 monoPAP
8:2 monoPAP	543	79，97	38	73	¹³C₂-8:2 monoPAP
diPAPs
6:2 diPAP	789	97，443	39	102	¹³C₄-6:2 diPAP
6:2/8:2 diPAP	889	443，543	21	168	¹³C₄-6:2 diPAP
8:2 diPAP	989	97，543	40	126	¹³C₄-8:2 diPAP
PFPAs
PFHxPA	399	79，97	32	91	Cl-PFHxPA
PFOPA	499	79，97	36	150	Cl-PFOPA
PFPiAs
6:6PFPiA	701	401，501	50	195	¹³C₄-6:2 diPAP
6:6/8:8 PFPiA	801	401，501	55	232	¹³C₄-6:2 diPAP
8:8 PFPiA	901	401，501	43	232	¹³C₄-6:2 diPAP
FOSAs
FOSA	498	78，169	42	160
N-MeFOSA	512	169，219	24	97	d3- N-MeFOSA
N-EtFOSA	526	169，269	27	105	d-N-EtFOSA
FOSAAs
FOSAA	559	419，483	30	83	d3-N-MeFOSAA
N-MeFOSAA	570	419，483	25	80	d3-N-MeFOSAA
N-EtFOSAA	584	419，483	27	78	d5-N-EtFOSAA
Cl-PFESA
6:2 Cl-PFESA	531	83，351	26	112	¹³C₂-PFOS
8:2 Cl-PFESA	631	351，451	28	164	¹³C₂-PFOS
PFCAs
PFBA	213	119，169	8	30	¹³C₄-PFBA
PFPeA	263	119，219	10	30	¹³C₄-PFPeA
PFHxA	313	219，269	5	30	¹³C₂-PFHxA
PFHpA	363	269，319	10	47	¹³C₂-PFHpA
PFOA	413	269，369	8	39	¹³C₄-PFOA
PFNA	463	369，419	18	44	¹³C₅-PFNA
PFDA	513	319，469	17	40	¹³C₂-PFDA
PFUnA	563	469，519	16	52	¹³C₂-PFUnA
PFDoA	613	519，569	10	53	¹³C₂-PFDoA
PFTrDA	663	569，619	11	61	¹³C₂-PFDoA
PFTeDA	713	619，669	13	71	¹³C₂-PFDoA
PFHxDA	813	719，769	13	70	¹³C₂-PFDoA
PFODA	913	819，869	13	67	¹³C₂-PFDoA
PFSAs
PFBS	299	80，99	33	113	¹³C₂-PFBS
PFPeS	349	80，99	26	124	¹³C₂-PFBS
PFHxS	399	80，99，119	39	141	¹⁸O₂-PFHxS
PFHpS	449	80，99	42	156	¹³C₂-PFOS
PFOS	499	80，99，130	48	169	¹³C₂-PFOS
PFNS	549	80，99	42	249	¹³C₂-PFOS
PFDS	599	80，99	48	215	¹³C₂-PFOS
PFDoS	699	80，99	55	256	¹³C₂-PFOS
内标物
¹³C₄-PFBA	217	172	8	30
¹³C₄-PFPeA	266	222	5	30
¹³C₂-PFHxA	315	270	10	30
¹³C₂-PFHpA	367	322	24	47
¹³C₄-PFOA	417	372	7	39
¹³C₅-PFNA	468	219	16	45
¹³C₂-PFDA	515	470	17	40
¹³C₂-PFUnA	565	520	10	53
¹³C₂-PFDoA	615	570	10	53
¹³C₂-PFBS	302	80，99	31	113
¹⁸O₂-PFHxS	403	103	36	111
¹³C₂-PFOS	503	80，99	49	188
¹³C₈-PFOS	503	80，99	49	188
¹³C₂-4:2FTSA	329	81，309	29	76
¹³C₂-6:2FTSA	429	81，409	23	109
¹³C₂-8:2FTSA	529	81，509	26	102
¹³C₈-FOSA	506	78	42	160
d-N-MeFOSA	515	219	25	110
d-N-EtFOSA	531	419	20	104
d3-N-MeFOSAA	573	419	19	101
d5-N-EtFOSAA	589	419	20	78
¹³C₂-6:2 monoPAP	445	97	16	70
¹³C₂-8:2 monoPAP	545	97	18	73
¹³C₄-6:2 diPAP	793	445	30	114
¹³C₄-8:2 diPAP	993	545	21	134
Cl-PFHxPA	415	79	32	103
Cl-PFOPA	515	79	35	101

2.2尿液收集及分析方法
采集了湖北一氟化工厂附近的15名职业工人和15名普通人的尿液样本，200μL尿液加入内标混合溶液（5 ng·mL^-1）混匀后转移至进样小瓶。在线检测系统的仪器初始位置为样品负载位置，如图1（a）所示，尿液样品经自动进样器注入TurboFlowSPE柱（Cyclone-P，1.0×50mm，ThermoFisher Scientific，USA），左泵的初始流动相为2 mL min^-1，100%A，样品加载1.0 min以清理基质杂质。样品净化后，六通阀切换至样品洗脱位置（图1（b）），将TurboFlow柱保留的分析物解吸并洗脱到分析柱（ZorbaxExtend C18，3.0×150mm，3.5μm，AgilentTechnologies Inc，USA）上以进一步分离和检测，分析泵流速为0.4mL min^-1。然后，六通阀切换至负载位置（图1（a））。为了保证TurboFlowSPE柱的可重复使用性，样品洗脱后，负载泵要用1mL min^-1MilliQ-水:ACN:MeOH:IPA（V:V:V:V=1:1:1:1）冲洗TurboFlow柱5.5分钟以去除残留的杂质。然后，负载泵的流动相恢复到初始比例以准备下一针样品的进样检测。分析柱温度设定在40℃。加载和分析泵的在线SPE程序和HP$$lc梯度洗脱条件以及阀切换的时间在表2中列出。

图1在线湍流固相萃取-液相色谱-质谱联用系统示意图

表2. 在线检测尿液中PFASs的洗脱程序

时间 (min)	左泵				时间(min)	右泵				阀位置
时间 (min)	流速	%A	%B	%C	时间(min)	流速	%A	%B	%C
(mL min^-1)	(mL min^-1)	%A	%B	%C			%A	%B	%C
0	2	100	0	0	0	0.4	90	10	1-2 ^a
3	2	100	0	0	1	0.4	90	10	6-1^b
3.5	1	0	0	100	2	0.4	90	10	6-1
6	1	0	0	100	3	0.4	55	45	6-1
9	1	0	0	100	6	0.4	23	77	1-2^c
9.5	1	0	100	0	12	0.4	0	95	5	1-2
15	1	0	100	0	15	0.4	0	95	5	1-2
15.5	2	100	0	0	15.2	0.4	90	10	1-2
19	2	100	0	0	19	0.4	90	10	1-2

注：a. 1-2：负载位置（0-1 min）；b. 1-6: 洗脱位置（1-6 min）；c. 负载位置（6-19 min）左泵流动相：A. 0.1% 甲酸水溶液（pH调至4），B. 乙腈和甲醇（体积比1:1），C. 超纯水:ACN:MeOH：IPA（V:V:V:V=1:1:1:1），右泵流动相：A. 2mM醋酸铵缓冲溶液（pH 用氨水调至 10.5）, B. ACN和METH（V:V=1:1）的混合溶液中添加5 mM 1-MP，C. 超纯水：ACN：MeOH：IPA（V:V:V:V=1:1:1:1）
质谱仪使用负离子ESI源多反应监测（MRM）模式进行扫描，母离子和子离子参数如表1所示，待测PFASs采用两个子离子分别作为定性和定量离子，以确保检测方法的准确性。对于PFOS和PFHxS，采用三个扫描离子，分别作为定性、定量和确定性离子，以避免内源性物质共洗脱现象的干扰。MS相关参数设置如下：鞘气，40单位；辅助气，12单位；源电压，2500V；汽化器温度，350℃;毛细管温度，400℃；扫描时间0.01秒。
2.3方法验证，质量保证和质量控制
制备标准曲线，浓度依次为0.002，0.005，0.01，0.02，0.05，0.2，0.5，2,5，10，20，50和100ng·mL^-1。利用添加一系列低浓度标准溶液的普通尿液来获得目标PFASs的方法检测限（MLOD）和方法定量限（MLOQ），信噪比等于3对应的浓度表示为MLOD，信噪比等于10对应的浓度表示为MLOQ。进一步，利用添加低浓度（0.05ng·mL^-1），中浓度（0.5，5ng·mL^-1）和高浓度（50ng·mL^-1）标准溶液的一个普通人尿液样品来评价方法准确性和精密度。
为了避免背景污染，将所有实验材料都更换为不含氟的PP管和PEEK材料容器。所有的容器和设备使用前均用甲醇进行清洗，分析过程中使用的所有溶液和试剂在使用前要确保其中不含PFASs。在进行仪器分析之前，多次注入纯甲醇来监测仪器背景值，直至仪器背景基线稳定且PFASs的背景水平低于方法检出限后，方可进行真实样品检测。进样过程中，每隔8个样品插入一针程序空白（纯乙腈）用来监测仪器中PFASs的背景浓度。随后插入一针含2ng·mL^-1标准溶液来监测PFASs出峰强度的稳定性以及保留时间是否存在漂移问题。
3结果与讨论
3.1 在线湍流固相萃取柱-高效液相色谱程序的条件优化
为了获得最佳的色谱分离效果，当萃取柱切换到分析流路时，需要将保留在TurboFlow柱上的的分析物洗脱下来并富集在分析柱上。对于样品负载阶段的条件优化包括：TurboFlow柱的选取，样品进样体积、样品负载流速、样品净化和洗脱时间以及洗脱流动相条件的优化。对样品分析阶段来说，要对分析柱进行选择，然后优化分析泵的HP$$lc参数，包括分析流动相的组成、水相流动相的pH值和分析泵流动相的流速等。
首先，对两种TurboFlow柱的PFASs保留效果进行了比较。硅胶基TurboFlowC18-P柱和聚合物基的TurboFlow Cyclone-P柱均可同时保留极性和非极性化合物，分别利用这两种柱子对10ng·mL^-1PFASs标准溶液进行分析（设置5个重复样）。文献报道中，短链PFASs和长链PFASs是检测困难较大的化合物，因此，我们在方法优化的时候，重点关注了这几种PFASs。使用C18-P色谱柱没有发现PFBA或PFPeA的出峰，而使用Cyclone-P柱时，不仅短链PFASs，PFBS和PFBA有出峰，PFHxDA和PFODA等长链PFASs也均有出峰，因此选择Cyclone-P柱作进一步方法条件优化。样品负载流动相的流速会影响萃取和基质消除的效率，这是在线TurboFlowSPE检测的关键参数。我们利用实验测试了不同加载流速（1.0，2.0，3.0和4.0mL min^-1）对PFASs的提取效率。随着流速的增加，PFASs的出峰强度先增加再降低，加载流速设置为2.0 mL min^-1 时，峰值强度最高，因此选择2.0 mL min^-1作为样品负载流动相。样品负载过程中，样品清洗程序可以消除杂质以保证目标分析物的最佳响应值。文献中多采用0.1%甲酸（流动相A）和乙腈（流动相B）沉淀蛋白质。本研究测试了不同比例的0.1%甲酸（流动相A）和乙腈（流动相B）作为上样溶液，使用乙腈时，短链PFASs的峰强度和峰型并不理想，基本观察不到PFBA的出峰情况，而使用0.1%甲酸作为样品负载流动相时，各PFASs的出峰效果较好。当洗脱时间从1分钟增加至5分钟时，检测到的PFASs的峰强度显著增加，而洗脱时间超过5分钟时PFASs的峰强度没有明显增加，有些PFASs甚至有下降趋势。因此，最终采用的样品洗脱时间为5分钟。
对比了纯甲醇，纯乙腈以及甲醇和乙腈的混合物（V:V=1:1）的对TurboFlow柱上的PFASs的洗脱效率，甲醇和乙腈的混合物比单独的纯甲醇或纯乙腈的洗脱效果都好，这可能是由于乙腈洗脱PFASs的能力强于甲醇，而甲醇清除杂质的能力要优于乙腈，两者混合使用时可以最大程度地降低背景噪声，并保持仪器的最佳灵敏度。为了实现所有目标PFASs的更好分离，进一步对分析泵流速（0.3至0.6mL min-1）进行了优化。在0.4 mL min^-1时的色谱峰形和强度最好，这可能是由于较低的流速有利于提高分离效率。最终，利用优化后的方法得到了43种PFASs的色谱图（图2）。

图2在线检测43种PFASs的色谱图

3.2本方法的线性系数，MLOD，准确度和精确度
本研究总共使用了27种PFASs同位素标记的内标用来校正基质对电离效率的影响以及补偿进样过程和质谱信号的变化。所有目标化合物在0.05-50ng mL^-1范围内呈现良好线性关系(r² >0.99)，检测限在0.008-0.19ng mL^-1 之间。方法具有良好的加标回收率（86%-109%）和精密度（日内：1.7-9.2%，日间：1.3-11.5%）。与现有文献比较，本方法PFASs的检测中表现出更低的检出限和更优的回收率。

3.3真实人体尿液样品中的PFASs的检测
为了验证本研究所建方法的实用性，我们将所建立方法对15名普通人和15名职业工作人员的尿液样本中PFASs进行了分析。PFBA和PFBS是最主要的两种检出物，在职业工人尿液中的浓度中值分别为18.96 ng·mL^-1，47.8 ng·mL^-1；在普通人尿液中的浓度中值分别为1.32 ng·mL^-1，3.43 ng·mL^-1。其他PFASs，PFOA，PFHxS和PFOS在普通人的浓度中值分别为0.35，0.73和1.02 ng·mL^-1，职业工作者的平均浓度分别为1.08，2.41和5.37 ng·mL^-1。6:2 FTSA是主要前驱体化合物，普通人和职业工作者中6:2 FTSA的平均浓度分别为0.12 ng·mL^-1和0.31 ng·mL^-1。总的来说，与PFCAs和PFSAs相比，尿液中的氟化物前驱体的浓度相对较低。短链PFASs的浓度比传统PFASs的高，这与其水溶性高的性质有关。
4总结
建立了一种可以同时测定人体尿液中10类43种PFASs的在线湍流固相萃取-高效液相色谱-串联质谱联用方法。该方法能在19分钟分析25微升尿液中PFASs的浓度，且方法的线性系数，方法检测限，基质加标回收率和相对标准偏差能够很好地满足PFASs的检测要求。方法成功应用于从15名普通人和15名职业工作人员收集的尿液样本PFASs的检测中。未来，本方法在同时检测人体尿液中痕量PFASs，特别是在样品量很少的大规模流行病学研究中具有很大的优势。
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