5.3.3 安培检测器的原理

安培检测器属于电化学检测器中的一种，是在外加电压的作用下，待测物质（具有电活性）会在工作电极表面上发生氧化还原反应。在氧化反应过程中，电活性被测化合物的电子从工作电极转移到安培池；反之，在还原过程中，电子从被测化合物转移到工作电极。这些电流的变化，该电流符合法拉第定律，通过对电流的检测可以推算出待测物质的浓度。其主要用于易于发生氧化还原反应的物质分析，如果有些干扰物无法发生氧化还原反应，就没有检测信号，不被检测到。

在离子色谱应用中安培检测主要包括恒电位（直流安培）、脉冲安培以及积分脉冲安培三种方式。

5.3.3.1 伏安法

在现成的离子色谱中，基本所有的被测化合物的分析方法已经固定，但作为未知化合物的分析，需要采用伏安法，其是确定安培检测器最佳工作电位的一种电化学技术。

其方法是工作电极表面不断通过含有被测化合物组分的溶液和支持流动相介质，测量其氧化和还原反应过程中产生的电流。并以此电流对指定范围内扫描的工作电极作图，得到伏安波形图。

扫描时，先以正向对电流进行扫描，然后反向进行扫描，从起始点开始，到起始点结束，起点电位等于终点电位，此法称为“循环伏安法”。

下图是葡萄糖在0.1mol/L KOH条件下，在金电极和Ag/AgCl参比电极上的循环伏安图

图中虚线是0.1mol/L KOH溶液在没有葡萄糖时所引起的电流，即为背景电流。从-0.8V开始正向扫描到0.25V还是平坦的，再升高电压后，金电极开始表面氧化。接着从0.6V开始反向扫描，金氧化物还原成金，负峰电流在0.1V。

在溶液中加入葡萄糖，从-0.8V开始正向扫描，电流略有变化，但不太明显，从-0.15V开始变化明显，电流升高，到0.25V为峰值，然后电流减少，其原因是表面的大部分葡萄糖已经被氧化，另一个因素是金氧化物的生成阻止了葡萄糖的进一步氧化。当反向扫描时，金氧化物开始被还原成金，葡萄糖也一样，负峰电流在0.15V左右。

在下述电化学反应中：

当反应正向进行时，A将n个电子转移至工作电极，并被氧化成B，反向进行时，B被还原成A，用Nerst方程表示为：

公式：均有特定的E⁰，

式中，Eapp为工作电极，E⁰为[A]=时的电位，[A]、分别为电极表面A与B浓度，mmol/L。

在实际的每个氧化还原反应中，都有一特征E⁰值，在Eapp=E⁰, lg /[A]为零；因此=[A]。如果Eapp设定为大于E⁰，因此，>[A]。反应向右进行，这一反应过程代表A物质氧化成为B物质，产生阳极电流，相反，设定Eapp小于E⁰，导致B还原成A，产生阴极电流。

考虑仅有A物质存在于溶液中，而E⁰为＋0.4V，对Ag/AgCl参比电极，图3-7所示为电流与施加电位函数的伏安图。

从伏安图可见，当外加电压为0.2V时，Eapp小于E⁰，B更易还原成A，因此溶液仅含有物质A，没有反应发生。随着电位的增加，A被氧化B，并且与[A]的比值随之增加。在更高的电位下（0.6V），到达工作电极表面的A被100%氧化成B，而电流不再随着电位的增加而增大。

施加电位与电流的关系曲线

安培检测器根据所施加的电位的方式不同，可分为直流安培法，施加固定的单电位；以及脉冲安培法和积分安培法，施加多重顺序的电位。

5.3.3.2 直流安培法（Direct amperometric detection，DC）

直流安培法又称恒电位安培法，在液相色谱中直流安培检测器是使用最广泛的电化学检测器，直流安培中施加到工作电极上的是一个恒定的直流电位，当待测物发生氧化还原反应时会产生电流信号，但电极本身为惰性，不参与氧化反应，或者电极可以与待测物形成沉淀/络合物参与氧化反应。

选择最佳的工作电位对于直流安培的检测非常关键，选择合适的工作电位是为了使电化学活性分子处于扩散的控制平台区，取得最佳的信噪比。最佳的工作电位是极限扩散电流最小时的电位。

若选择的电位高于最佳电位（待测物可以产生极限扩散电流的最小电位）时，会使其他不需要检测的物质响应从而降低了选择性，并且噪声增加^[33]。低于最佳电位，虽然噪声下降，但检测灵敏度也下降，从图上可以看到，对于5-羟色胺最佳的施加电位约在0.7V左右。

图3-10为施加电位与色谱峰信号的关系图（5-羟色胺）

直流安培具有很高的灵敏度，可以测定ug/L的无机物和有机物，主要用于测定那些被氧化还原反应对工作电极不易产生污染的化合物。例如含有酚或儿茶酚功能基的化合物，许多药物或生物分子带有这类功能基，其中最重要的是儿茶酚胺类中的多巴胺、多巴及其它生物神经传递物质；止痛药醋氨酚也含有酚功能基并易于检测；氨基酸中的酪氨酸也含有酚功能基，不仅这个氨基酸可以被检测，而且任何含有酪氨酸多肽也可以用安培检测。

此外还有一些含芳香胺、硫醇和含硫的有机化合物也可以采用直流安培检测。除了这些有机分子，一些易于与银形成络合物的无机阴离子如氰、硫化物和碘可以用银电极以直流安培方式检测。

5.3.3.3 脉冲安培法（Pulsed amperometric detection, PAD）

脉冲安培检测器是起源于对糖检测的需要，绝大多数糖在低紫外区的灵敏度和选择性较差，示差检测器的灵敏度不够无法满足糖的检测需求，当时并没有ELSD、NQAD以及CAD、MS检测器，脉冲安培成为糖检测优先考虑的方法。

20世纪80年代中期，之前作为测糖的主要方法的光度法逐渐被PAD取代。由于使用恒定电位进行检测时，在工作电极表面会富集氧化反应的产物，从而抑制了进一步的检测。为了解决工作电极表面被钝化的问题，PAD中使用了E_det、E_oxd、E_red三阶电位，每个电位的持续时间分别为t_det、t_oxd、t_red，如图1.2（左）所示。E_det用于检测时间段(t_det)，是工作电位，在该电位下测待测物的氧化电流，为了扣除电极表面的充电电流，其中包括一个延迟时间周期(t_del)；然后E_oxd 是比E_det高的氧化清洗电位，使得吸附在电极表面的反应产物能够脱离电极从而继续进行检测；E_red为比E_det负得多的还原清洗电位，使工作电极表面还原为金属本身，再回到电位E_det，如此循环，这样保证了检测的重复性和灵敏度。

脉冲安培检测的电位和时间参数的设置非常关键，在将脉冲安培法应用于糖类化合物检测时，要求糖类在检测电位处被氧化，工作电极的响应在清洗和调整脉冲期间恢复。检测、清洗和调节电位的选择应基于金工作电极的伏安特性和用于分离的移动相中要检测的糖类^[^34]。Rocklin等^[22]在1998年提出了新的四电位波形，如图1.2（右）所示。该波形能够降低工作电极的损耗，提高了测样的重复性，延长了工作电极的使用寿命。

图1.2 脉冲安培检测的三电位（左）和四电位图（右）

除了糖以外，脉冲安培可以用于检测含有醇、乙醛、胺以及含硫基团的化合物的检测。

5.3.3.4 积分安培法（Integrated pulsed amperometric detection, IPAD）

积分脉冲安培是另一种新形式的脉冲安培技术，1989年由D.Johnson等提出，并将其用于氨基酸的分析，早期积分脉冲安培被称为电位扫描脉冲库伦检测。

积分安培的电位也可以通过循环伏安法进行，下图是亮氨酸的脉冲和积分的伏安图。

图所示在0.1mol/L NaOH溶液中，金电极分析亮氨酸时，脉冲和积分安培检测器的循环伏安图的比较。对于脉冲安培，在一个脉冲周期中，在单一电位下对电流积分。当用积分安培时，在一个循环电位下的正反向扫描得到的电流积分。

也就是说，脉冲安培（PAD）对电流的测量是基于单次脉冲，所以需要一个短暂的间隙过程以便使充电电流衰减。而积分安培的检测由于其电流的检测是在一个循环过程中，正反向连续积分的，没有待测物存在时，净电荷为零，因此大大降低了氧化还原产物对电极的影响。其优点在于能消除由于在色谱中使用梯度而引起的pH值和流动相组成的微小变化所带来的漂移和变化，使得检测基线稳定并且检测信号变强[35]。

积分安培检测，需要反应基团的原子至少有一对孤对电子的存在，使其在未氧化的电极表面吸附，鉴于其特点，非常适合那些具有未成键电子基团N，S的胺和硫化合的检测。例如糖、氨基酸、蛋白质、抗生素等。

图1.3 积分安培检测的四电位图

为了减少工作电极的溶解，也就是解决金电极表面生成的金氧化物对电极重现性的负面影响，Clark等^[^36]对IPAD的波形也做了改进，在无需衍生化的情况下使用了六电位波形来分析氨基酸和氨基糖。通过在波形积分之前加入更多的负电位，可以最大限度地减少由于过多的氧化物形成而导致的电极表面贵金属的损耗。此外，与传统的IPAD波形相比，包含了更短的吸附步长，从而实现了更有效的循环，而不会限制氨基酸的线性范围。利用六电位波形进行检测结果显示，该工作电极干净且无明显的电极衰退和信号丢失，在连续一周的检测下，检测所有氨基酸的峰面积的RSD小于2%。

蔡亚琪等比较了三电位、四电位和六电位对氨基糖苷类抗生素测定的信号响应、信噪比、检测灵敏度和线性等参数的影响，六电位可以获得最好的结果，并用于氨基糖苷类抗生素的检测，见下图。

时间/s	电位/V	积分
0	-0.25
0.04	-0.25
0.05	-0.05
0.21	-0.05	开始
0.22	0.22
0.46	0.22
0.47	-0.05
0.56	-0.05	终止
0.57	-2
0.58	-2
0.59	0.55
0.6	-0.25

5.3.3.5迟滞时间

采用脉冲安培和积分安培检测器，氧化电流积分迟滞允许电荷电流衰退。类似的三电位波形用于检测其它物质，特别是糖和醛。图3-15为金工作电极糖类测定时，背景电流与迟滞时间的相关性。

图3-15 金工作电极的迟滞时间与背景电流的关系图

图3-16是通过改变积分时间后得到的结果。0.2秒的迟滞时间是足够允许电荷电流迟滞并接近于零。

图3-16 色谱峰面积与迟滞时间的相关性

从0到0.2秒之间的响应值减少不多，但迟滞时间至少0.2秒可提供最佳信号-噪声比。

5.3.3.6电位极限

负电位极限是流动相或支持电解质被还原的电位。正电位极限是流动相，支持电解质或电极本身能够被氧化的电位。因为这些反应产生的电流远远超过溶质氧化还原反应所产生的电流，因此用于检测被测物的电位必须限定在此范围内。在表3-2列出的4种电极材料在酸性或碱性条件下的电位极限，这些电位极限受流动相的pH影响很大。在碱性条件下，负电位极限更负，而在酸性条件下，正电位极限更正。

当施加电位接近于电位极限，噪声将随着背景电流的增加而增加。对于金属电极上，背景电流的快速增加就是电位极限的接近。而玻碳电极中，背景电流的增加更为平稳。电位极限值是根据所要求的信噪比测定得到的。

表3-4Ag/AgCl参比电极下的电极电位

工作电极

溶液（0.1mol/L）

负电位极限（V）

正电位极限（V）

玻碳（G.C.）

KOH

HClO₄

(-1.5)

(-0.8)

(+0.6)

(+1.3)