这其中的一些步骤并不是必需的,或者它们不需要我们花太多的精力。“困难”的样品和要求很高的分析程序可能会超出简单重复上面所罗列的步骤的范畴。也就是说,在方法建立过程中出现特殊问题的时候,需要有一个逻辑的对策,以色谱操作员之前的经验和对文献记录的接触或熟悉程度为基础。

▉ 样品组成和分离目标的评估
在方法建立之初,应该对样品的化学组成有一定的掌握。如果样品中有酸性或者碱性的化合物,那就有必要在流动相里加入缓冲液来控制流动相的pH;样品化合物的pKa值,如果知道的话,对方法建立都会非常有帮助,样品的分子量也有可能影响起始实验分离条件的选择,样品中存在有对映异构体的则需要针对它们的分离建立一个特殊的方法。
一个样品的分离目标可能不仅仅局限于足够的分离度和最短的分离时间。对于最终方法的常规应用取决于可用的设备,梯度洗脱可能无法实现(那就需要等度洗脱的方法)。痕量分析,也就是测定化合物中的杂质,可能对样品配备和检测器都有额外的要求。定量分析要求设定最低的精确度(比如主要成分在±(1%-2%)之间和痕量成分在±(10%-20%)之间),然而,通常来讲样品中只有一些成分需要被分离;例如,血中或尿液中的药物或者水或土壤里样品里的杀虫剂。
▉ 样品的预处理
在样品进样之前可能需要对样品做一些处理以便能除去那些可能会损害柱子或者干扰目标的化合物成分。样品的预处理流程包括多个步骤,并且也包括使用各种各样的分离基质。因为这个原因这些步骤比后面的HPLC分离更加难以建立。当相似的样品和样品基质的预处理流程已经存在(或者在同一个实验室建立或者在文献里报道过),针对分析样品来使用或者改编现有的预处理流程通常是比较好的方法,因为这样就可以避免完全重新建立样品预处理的程序了。
▉ 色谱模式的选择
反相色谱法是HPLC方法建立的一个默认选择。但是,取决于样品本身,其他的色谱模式也许会更合适。通常要等到初始的使用反相色谱法(RPC)的实验无法成功的时候,使用其他色谱模式的需求才会变得更加明显。同理,如果样品中有异构体化合物,而且难以被反相色谱分离,那么使用以无键合的硅胶填充的色谱柱的正相色谱法(NPC)可能会更加容易获得成功。无键合硅胶的正相色谱法也是制备规模分离的首选。
▉ 检测器的选择
当样品成分中有足够的生色团,可调波长的UV检测器一般是首选。目标样品成分的分子结构可能预示使用一种检测器会比另外一种检测器更加合适,假如样品成分的结构是未知的,并且可能不能被UV检测,那么我们在分析这些样品的时候就需要使用基于蒸发光散射或者(比较少见)折光指数的非特异性检测器。质谱检测器(LC-MS)可用作UV检测器的补充,因为它的多功能性因此可以用于处理很多类型的样品和分离目标。我们可以预见,将来LC-MS技术的使用可能会大幅上升,而质谱检测器可能有一天会成为大多数HPLC应用首选的检测器。
▉ 分离条件的选择
对于大多数样品,我们可以根据三个连续的步骤以一个系统化、反复测试的方法来进行(分离条件的选择)：

1、改变流动相的强度(%B)直到实现合适的保留范围,比如,1≤K≤10；

2、应对不同的分离条件进行研究直到获得可接受的选择性(a值)和分离度为止。为了改善选择性,首先需要改变的色谱条件应为%B(例如±10%B)和温度(例如30-50℃),如果一些峰仍然重叠或者分离不彻底,也可以改变其他条件来改善选择性。

3、改变柱子的条件:柱子长度、颗粒大小和(或)流动相流速。改变柱子条件的确能够稍微提高塔板数N和分离度,但代价通常是要忍受更长的分离时间(实验操作时间),当优化选择性完成之后,样品的分离度比必需的(R>>2)还要更好的话,那么通过把柱子长度缩短和(或)者增加流动相流速就让实验时间大幅缩短。基于上面描述，在多数情况下,满意的分离效果可以在一天或者两天内实现。

对于那些涉及大量样品的分析方法,在保持足够分离度的同时还要让实验操作时间尽可能地短,因此在实验的初期花更多的时间展开“筛选”实验是更有价值的。实验中可能会使用不同的柱子、不同的B溶剂和不同的流动相pH以及不同的温度。在实验中使用梯度洗脱的方法有助于避免研究每个变量(例如柱温、色谱柱的类型都属于变量)时都需要分别优化%B值的麻烦。

还有一个方法就是搜索文献中对于同样或者类似样品的分离方法的记载。在此基础上还需要不断进行反复试验来优化色谱条件直到获得适合的分离效果。我们不推荐这个方法,因为文献中的方法可能存在不足;这此不足可能会延误我们之后为了获得最终可靠的分离方法而作的尝试。然而除了选择分离条件之外,文献记载的分离方法对于选择检测器和检测条件,以及为一个特殊的分析物或样品选择样品配备方法都很有用。

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