主题：【第十四届原创】一种分析方法搞定动物源性食品中多种兽药残留检测能力验证

一种分析方法搞定动物源性食品中多种兽药残留检测能力验证

1 引 言

兽药残留是指“兽药在动物源食品中药物残留”的简称, 畜禽机体在用药后积蓄或存留在体内的原型药物或其代谢产物, 一般规定其可食用部分的药物残留。近年来，在畜牧养殖、渔业生产等过程中存在一定的滥用、误用兽药现象，因为它们不会随食品加工而消失，其中一些兽药可以通过食物链的积累和生物自身代谢残存下来, 如果超过一定程度, 会对人体健康造成严重损害，或对人体产生耐药性或过敏反应等副作用。而由兽药残留问题造成的技术性贸易壁垒也给实验室检测工作的带来了新的挑战和要求。

实验室能力验证, 是指利用实验室间指定检测数据的比对, 确定实验室从事特定测试活动的技术能力，是对检测机构资质认定工作和农产品质量安全检测机构考核工作有效性的后续监督的重要措施。近年来，越来越受到监督管理部门的重视。同时，检验检测机构为了促进自身的发展，也越来越多地主动寻求能力验证和能力比对的机会。本中心实验室已连续两年参加了由农业农村部和湖南省农业农村厅组织的动物源性食品兽药残留的能力验证，均获得了满意的结果。在实际检测工作中,同一个检测项目相关的检测标准较多,涉及的前处理方法和所用仪器设备均有差异,需要根据检测目的和要求选择使用。为了解决兽药残留检测中由于标准方法理解不到位和操作熟练程度较低,出现检验结果有偏差的问题, 我们根据《能力验证作业指导书》和日常兽禽水产品中兽药残留检测经验及相关文献, 结合国家检验标准方法进行实验，通过优化前处理方法和仪器条件,同时测定多类兽药残留量。旨在为高效识别样品中潜在兽药,评价动物源食品的整体安全性提供重要的技术手段。同时，本文对2020年参加的农业农村部畜禽类产品中氟喹诺酮类药物和β-受体激动剂残留检测能力验证以及农业农村部水产品中氟喹诺酮类药物和湖南省农业农村厅水产品中孔雀石绿残留检测能力验证的实验过程及结果进行分析,希望为同类食品质检机构提高动物源性食品中兽药残留的检测能力和能力验证整体水平提供参考。

2 材料与方法

2.1 样品

样品由能力验证组织机构提供，本次畜禽产品中兽药和违禁添加物残留检测能力验证每个项目提供2个平行双样,均为空白添加样品，不提供空白样品。β-受体激动剂项目为牛肉样品,每个牛肉样品2.00g,编号为β58;氟喹诺酮类药物项目为鸡肉样品,每个鸡肉样品2.00g,编号为F58。水产品中氟喹诺酮类药物项目样品为鲤鱼肉，样品、空白各约30g，编号为F25。水产品中孔雀石绿项目样品为草鱼肉，样品、空白各约30g，编号为SYZ20_K9。所有样品均为塑料瓶包装,常温运输, –18 ℃保存。

2.2 试剂与仪器

诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、培氟沙星、洛美沙星、达氟沙星、沙拉沙星、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、氯丙那林、孔雀石绿、隐色孔雀石绿以及所有内标（纯度均≥95%，德国 Dr. Ehrenstorfer 公司)；甲醇、乙 腈、甲酸(色谱纯, 德国默克公司)；实验室用水(实验室一级水);固相萃取柱（ProElut PLS-A 6 mL）（迪马科技有限公司）；ProMax 醋酸纤维素针头式过滤器 13mm 0.22μm CA（迪马科技有限公司）；QuEChERS陶瓷均质子（迪马科技有限公司）；超声仪（中国昆山超声仪器有限公司）；电子分析天平（瑞士Mettller－Toledo公司），感量 0.1 mg; Vortex3 涡旋仪(德国 IKA 公司); CF5RE 离心机 ( 日本日立公司 ); N-EVAP-12 氮吹仪 ( 美国 Orgnamation 公司); UPLC-Hclass-TQD 液相色谱串联质谱仪(美国沃特世公司)。

2.3 实验方法

2.3.1  标准溶液配制

1.标准储备液的配制：分别准确称取适量的标准品，用甲醇溶解并定容，难溶解的添加适量甲酸并超声助溶，配置成 1.0 mg/mL 的标准储备液，于－18℃冰箱中避光保存。有效期半年。

2.混合标准中间液（1μg/mL）的配制：分别准确移取标准储备液各0.1 mL，用甲醇定容至100ml， 4℃下避光保存。有效期一个月。

3.混合标准工作液的配制：根据实验需要,用0.1％甲酸水∶甲醇(v/v＝9/1)配制适宜浓度的标准工作液, 现用现配。

内标配制方法相同。

2.3.2 样品前处理

准确称取样品(2±0.05) g, 于50 mL离心管中, 加入适量内标混合标准中间液（1μg/mL）涡旋混匀，先加一粒陶瓷均质子，再加入8 mL含0.2%甲酸的80%乙腈水溶液提取, 涡旋30 s, 超声10 min，10000 r/min低温(5℃)离心5 min, 取上清液5mL直接过固相萃取柱（ProElut PLS-A 6 mL），收集滤过液，再准确量取4.0 mL样液，40℃氮吹至近干，用0.1％甲酸水∶甲醇(v/v＝9/1)复溶并定容至1.0 mL，过 0.22μm 滤膜，待上机检测。

2.3.3 色谱条件

色谱柱: ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 mm×100 mm, 1.8 μm)；柱温: 40℃; 流速：0.25mL/min；进样量: 2 μL; 流动相A(0.1%甲酸水)与B(0.1%甲酸甲醇)梯度洗脱, 梯度洗脱程序如表1。

表 1 流动相梯度洗脱程序

2.3.4 质谱条件

电喷雾离子（ESI +）源正离子模式，多反应监测（MRM）；毛细管电压：1.5 kV；离子源温度：120 ?C；脱溶剂气温度：450 ?C；脱溶剂气流速度：750 L/h；锥孔气：150 L/h；碰撞气流速：0.12 mL/min。各化合物母离子、定性、定量离子对及对应的锥孔电压和碰撞能量。见表2。

表2 母离子、定性、定量离子对及对应的锥孔电压和碰撞能量

注： * 为定量离子

2.3.5 样品检测

氟喹诺酮项目混合标准工作液配制为1.0、5.0、10.0、20.0、40.0、 80.0 、120.0μg/L，内标物混标浓度为40.0μg/L；β-受体激动剂项目、孔雀石绿项目混合标准工作液配制为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0μg/L，内标物混标浓度为4.0μg/L；内标法绘制标准工作曲线, 测试样品后, 内标法定量。同时采用空白基质（市场上购买）配制相应标准曲线，测试样品后，外标法定量。每个样品进行3次重复测定。

3 结果与分析

3.1提取液的选择及优化

乙腈被广泛作为优选有机溶剂，其具有沉淀蛋白的能力，并能提供杂质较少的提取液。为了最大限度提取不同种类的兽药，实验中使用甲酸酸化的乙腈溶液提取目标化合物。 由于过高的甲酸添加量会对磺胺类等化合物回收率有影响，故本实验中选取添加0.2%的甲酸于提取液中，实验设定含0.2%甲酸的90%乙腈水、含0.2%甲酸的80%乙腈水、含0.2%甲酸的70%乙腈水3种提取液，比较其对各类目标化合物的平均回收率的影响，发现含0.2%甲酸的80%乙腈水最为合适，回收率（75-120%）高也利于后续净化过柱和氮吹。本实验在样品前处理中添加陶瓷均质子涡旋30s，相比较传统的QuEChERS提取方法要求剧烈振摇样品1分钟，解决了动物源性样品遇酸化乙腈易结块而可能会引发均一性和回收率不佳的情况。本实验证明了在样品提取过程中，加入均质子，有利于样品萃取过程的均匀性，提高检测化合物的回收率（外标法定量回收率平均提高了10%左右）。如图1所示。

图1 添加均质子对外标法定量回收率的影响

3.2 净化方式的选择

动物源样品基质较为复杂, 大量存在于动物源性样品中的磷脂，干扰部分化合物分析定量，影响色谱柱寿命及仪器维护成本。本实验使用了新型材料的固相萃取柱（ProElut PLS-A 6 mL）净化样品，能有效去除磷脂等干扰杂质。同时，采用通过式净化策略能极大提高样品分析通量，并且经过特殊设计的ProElut PLS-A流速更快且不容易被堵，净化时间由30 min 缩短至3min,也极大的提高了效率。经测试, 样品经ProElut PLS-A 净化后14种兽药残留回收率（外标法）均不低于75%, 

3.3仪器条件的优化

3.3.1 色谱柱的选择

本实验对比了ACQUITYUPLC HSS T3 (2.1 mm×100 mm, 1.8 μm)、ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1 mm×100 mm, 1.7 μm) 两种反相色谱柱的分离效果, 发现 HSS T3 色谱柱可以有效分离以上14种化合物,且具有更好的高水相及酸碱的耐受性。因此选用此款色谱柱进行检测分析。

3.3.2 流动相的选择

有文献表明向流动相中加入甲酸可促进正离子模式下目标化合物的电离,增强响应信号。实验中设计了两种流动相体系0.1％甲酸甲醇－0.1％甲酸水，0.1％甲酸乙腈－0.1％甲酸水与不加甲酸的体系比较。结果发现加甲酸的两种体系灵敏度和分辨率提高、响应值提高，但两种体系间无显著差异。0.1％甲酸甲醇－0.1％甲酸水体系峰型无拖尾且对称，分离效果也好，作为本实验流动相的最终选择。 

3.3.3 质谱条件的选择

为获得最佳质谱条件以保证定性定量的准确性,实验前预实验中先对仪器质量轴进行了校正。并对比了不同毛细管电压、离子源温度、脱溶剂气温度、锥孔气流速等仪器条件对目标化合物响应值的影响，发现毛细管电压：1.5 kV；离子源温度：120 ?C；脱溶剂气温度：450 ?C；脱溶剂气流速度：750 L/h；锥孔气流速：150 L/h；碰撞气流速：0.12 mL/min最为理想。最终保存为仪器方法。本实验逐一使用单个标准品进样调手动谐优化质谱参数, 最终确定母离子质荷比及锥孔电压,各子离子质荷比以及碰撞能量，选择离子丰度较高、无干扰的子离子作为目标化合物的定量离子和定性离子。同位素内标的定量离子与外标物的定量离子尽量做到相同。详见表2。

3.4 检测方法的选择

近年来，动物源性食品中超痕量兽残检测方法的研究逐渐发展为2个方面, 一是通过建立快速处理样品前处理技术, 节约样品分析时间和成本; 二是提高样品痕量检测的灵敏度及建立多残留同步检测方法。本次能力验证四个项目分别推荐参考4个国家标准，4个国家标准方法前处理技术、灵敏度、定量方式、适用范围等各不相同，为了解决这个操作繁琐问题，本次能力验证实验统一了快速处理样品前处理技术，建立多残留同步检测方法。各标准方法同本实验方法比较详见表3。

本实验方法内标法测定的结果回收率在88.1％～118.0％之间，外标法测定的结果回收率在75.2％～115.3％之间，准确度和精密度、方法灵敏度完全符合NY/T 1896-2010《兽药残留实验室质量控制规范》中兽药残留检测方法性能标准要求。实际检测工作中，由于内标法是通过测量内标物及被测组分的峰面积的相对值来进行计算的，因而在一定程度上消除了操作条件等的变化所引起的误差。因不需要配制基质标准曲线，适合大批量不同类型样品的处理。内标法的缺点是操作程序较为麻烦，每次分析时内标物和试样都要准确称量，有时寻找合适的内标物也有困难，无形中增加了测试成本。外标法简便，但进样量要求十分准确，而且要严格控制在与标准物相同的操作条件下进行，而且对仪器的重现性和操作条件的稳定性要求高，否则得不到准确的测量结果。近年来由于检测仪器大量更新换代，自动进样器的普遍使用，外标法对仪器条件的严苛要求问题得到了根本解决，因此日常工作中，检测大批量同一类型样品应用外标法就能够满足要求，也简单省事。但对于精密度要求比较高、结果准确度会产生重大影响、实验室条件不是很理想的等条件下，用内标法还是必要的。所以本次能力验证采用内标法定量。

表3 动物源性食品中兽药残留检测推荐标准与实验方法比较

3.5 实验结果

本次能力验证实验采用内标法定量，实验结果如表4，此次能力验证结果均以添加回收率作为判定标准。所有结果都靠近回收率范围的中位，令人满意。说明实验采用的检测方法灵敏、快速、简单可靠。

表4 本次能力验证结果

注: ND 为未添加，理论上为未检出。

3.6 标准曲线的绘制

本实验用0.1％甲酸水∶甲醇(v/v＝9/1)配制内标法标准曲线溶液，氟喹诺酮项目浓度点为1.0、5.0、10.0、20.0、40.0、 80.0 、120.0μg/L，内标物混标浓度为40.0μg/L；β-受体激动剂项目、孔雀石绿项目浓度点为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0μg/L，内标物混标浓度为4.0μg/L。同时用市售空白样品经本方法前处理后得到的空白基质溶液，配制相同浓度点的外标法标准曲线。经测定，14个目标化合物在各自范围内呈现良好的线性关系，相关系数均在0.995以上,线性回归方程和相关系数结果见表5。

表5 14种兽药的线性回归方程和相关系数

3.7 回收率和精密度

本实验进行了添加回收实验来检验方法的准确度和精密度,。根据检测项目的MRL要求和历年能力验证添加水平情况,在空白样品中添加3个不同水平的添加样品 每个水平设5个平行，采用本实验方法进行测定，14种兽药的内、外标法回收率数据统计结果见表6。实验结果表明，本方法在3个浓度的添加回收率内标法为88.1％～118.0％，RSD为0.8％～9.6％，外标法添加回收率为75.2％～115.3％，RSD为2.6％～11.2％。方法准确度和精密度均可满足检测要求。

表6 14种兽药不同定量方法的准确度和精密度实验结果(n=5)

4 结 论

本研究实验建立了采用含0.2%甲酸的80%乙腈水溶液添加陶瓷均质子快速提取, 用迪马科技ProElut PLS-A 固相萃取柱通过式净化, 液质联用仪同时测定动物源性食品中14种兽药残留量的方法。本方法灵敏、快速、简单可靠，定量限为0.5～2.0μg/kg,添加回收率内标法为88.1％～118.0％，RSD为0.8％～9.6％，外标法添加回收率为75.2％～115.3％，RSD为2.6％～11.2％，准确度和精密度符合NY/T 1896-2010《兽药残留实验室质量控制规范》中兽药残留检测方法性能标准要求。采用本研究分析方法同时参加四项不同基质、不同种类药物残留的能力验证，所有结果都靠近添加回收率范围的中位，令人满意。