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动物源性食品己烯雌酚检验方法
—高效液相色谱法
1　范围
本方法规定了动物源性食品中己烯雌酚残留量的快速测定方法。
原理
试样中的残留的己烯雌酚经快速检测前处理试剂盒提供的试剂提取、浓缩、净化后用液相色谱进行检测，外标法定量。
3 试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。
3.1乙腈：色谱纯。
3.2冰乙酸：色谱纯。
3.3甲醇:色谱纯。
3.4无水乙酸钠。
3.5对-甲苯磺酸。
3.6乙酸盐缓冲液：称取4.950g无水乙酸钠及0.950g对-甲苯磺酸，溶解于950mL水中，用冰乙酸调节溶液pH到4.5，最后用水定溶到1000mL。
3.7标准品: 己烯雌酚
3.8标准贮备溶液:分别称取标准品各10.0mg，用甲醇溶解后转移至10mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，于—20℃条件下保存。使用时，用甲醇稀释上述标准储备溶液，配制成不同浓度的标准工作液。
3.9己烯雌酚快速检测前处理试剂盒*。
4 仪器和设备
4.1高效液相色谱仪：配紫外-可见检测器。
4.2匀浆机。
4.3旋转蒸发仪。
4.4离心机：4 000 r/min
4.5聚四氟乙烯离心管:100 mL，具塞。
4.6微孔滤膜:0.45 µm。
5测定步骤
5.1提取、浓缩、净化
准确称取已捣碎的样品10.00 g于50 mL离心管中,先加己烯雌酚快速检测前处理试剂盒中的提取剂(液体20.0 mL)、8000r/min均质1min，于4000 r/min离心5 min，取出上清液10mL用水稀释至30mL。残留物用2.0 mL蒸馏水溶解。取稀释液于层析柱中（使用前依次用5mL甲醇、5mL蒸馏水激活）挤干，加5mL洗涤剂洗涤挤干，加5mL洗脱剂洗脱，接收洗脱液，50℃水浴旋转蒸干，用1mL甲醇溶解残渣于0.45 µm微孔滤膜过滤，供仪器测定。

5.2绘制标准工作曲线
移取己烯雌酚混和标准溶液， 50µg/kg、100µg/kg、200µg/kg、500µg/kg、1000µg/kg标准工作溶液,样液用高效液相色谱仪测定，得出标准工作曲线。
5.3测定
5.3.1液相色谱条件
a) 色谱柱: C18柱，150 mm×4.6 mm(i.d.),粒度5m;
b) 流动相:乙腈+乙酸盐缓冲液 (70+20,体积分数);
c) 流速:1.0 mL/min;
d) 柱温:室温;
e) 检测波长：250nm
f) 进样量：20 L。
5.3.2色谱测定
根据样液中己烯雌酚的含量情况，选定峰面积相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中的己烯雌酚响应值均应在仪器的检测线性范围内。
5.3.3空白实验
除不加试样外，按上述测定步骤进行。
5.3.4结果计算
用色谱数据处理机或按式（1）分别计算供试样品中的己烯雌酚残留量。
                      2 ci×V
ω=          　…… (1)
m

ω－样品中己烯雌酚残留量，μg/kg；
ci －标准曲线上查出试样溶液中己烯雌酚标准工作溶液的浓度，μg/L；
2－换算常数；
V－最终定容体积数，mL；
m－供试试料样品重量，g。
6测定低限、回收率
6.1检测限
本方法的检测限己烯雌酚为10μg/kg。
6.2回收率
本方法回收率己烯雌酚为:85%～105%。