主题：我在提S3P,谁能救救我啊?

搞不定这个可就毕不了业了,5555~~~~谁帮帮我啊?我是按以下方法进行的提取，真空浓缩部分由于文献无具体说明，采取了冷冻干燥法(-30℃, appr.300mT, 48 hours)，但冻干后只见少许白色絮状物，未有文献所述之糖浆状物质出现，溶水后检测不到S3P。初步估计在这一步出现问题。后对洗脱液的S3P含量进行了检测，结果是在被浓缩的洗脱液内也检测不到含量，但不知是否是因为反应受洗脱液内有机溶液（例如乙醇）的干扰导致检测失败。另一部分洗脱液于一个密封容器中抽真空浓缩，条件是：0.1 ATM ，40-50℃， 20 hours，之后也未见糖浆状物质，所得浓缩液中也未检测到S3P存在。
查相关资料的印象是：活性炭只是提供一个洗脱介质，而且现在已经很不常用了。S3P的磷酸酯和羧基基团在酸性条件下应倾向于溶解在有机溶剂例如乙醇中，而在中性条件下则倾向于溶解在水中。也许能以离子交换树脂来纯化S3P，但对此没有具体的概念，极端缺乏有机纯化经验，着急中！


莽草酸-3-磷酸（S-3-P (shikimate-3-phosphate) ）的制备
.........COOH....
.........|.......
.........C.......
........//\......
......HC...CH2...
.......|...|.....
H2PO3-HC...CH-OH.
........\./......
.........CH......
.........|.......
.........OH......

依照P.F. Knowles & D.B. Sprinson(1970)所述的方法，从克雷伯氏肺炎球菌（Klebsiella pneumoniae） (ATCC 25597) 的培养液中提取。具体步骤如下：
(1)    接种Klebsiella pneumoniae (ATCC 25597)于12升Medium A中，37℃、 200 rpm 振摇培养90小时；
(2)    用Darco G60(100mesh)活性炭装在直径为5厘米、长约50厘米、下部有玻璃纤维填充的玻璃管中，形成层析柱；
(3)    培养完毕，以 5000 rpm离心20分钟，尽量弃清菌体，保留上清液作后续操作；
(4)    用盐酸调节上清液pH至3，并加入0.5mL甲苯，缓缓加到步骤（2）准备好的层析柱上，让有效成分充分吸附；
(5)    依次用2升已用盐酸调节pH 至2.5的水；1.5%、5%和10%的乙醇洗柱；
(6)    用500 mL 没酸化的5%乙醇再洗柱子一次；
(7)    依次用2.5升5%乙醇、3升10%乙醇、2升25%乙醇将吸附在柱子上的有效成分洗脱下来；
(8)    合并所有的洗脱液，用真空干燥法去除多余溶剂；
(9)    把经过步骤（8）后得到的糖浆状残留物，溶于150mL水中，并用氨水调节该溶液的pH 至7；
(10)    加入100mL乙酸钡与上述溶液反应；
(11)    加乙醇到反应液中，至80%（v/v）的乙醇浓度，把该混合物放置0℃过夜；
(12)    4000 rpm 、20分钟离心收取沉淀，弃上清；
(13)    用75%乙醇洗沉淀两次，再用无水乙醇洗沉淀一次；
(14)    真空干燥，除尽溶剂，便获得白色的S-3-P的钡盐(83)，定量后可用于EPSP合成酶酶活的测定。

附: Medium A 配方：
KH2PO4                3.0g/L
K2HPO4•3H2O        9.169g/L
NaCl                  0.1g/L
MgSO4•7H2O          0.1g/L
(NH4)2SO4              1.0g/L
L-tyrosine              10mg/L
DL-phenylalanine        20mg/L
L-tryplophan            5mg/L
ρ-aminobenzoic Acid    10ng/L
ρ-hydrobenzoic Acid    10ng/L


哪位大侠给我指指路啊,小女子叩谢先了~~~