主题：【讨论】极性物质分离、高含水流动相和相塌陷等问题

原文由 东风恶(luoleqc) 发表:
色谱仪已经很成熟了，但是色谱柱的话题将是一个永远新鲜的话题啊！

我感觉国内的仪器要赶上Waters或者Agilent还有很长的路要走

相塌陷的经典解释

反相色谱中固定相通常疏水性都很强,特别是长链烷烃高密度键合的情况下,疏水性更强。在高含水量的流动相环境下，固定相的疏水长碳链倾向于通过互相结合的方式尽量降低表面自由能，固定相的互相结合的结果使填料多孔结构的表面“失湿”，也就是不能很好被流动相润湿了。这个时候，在流动相中的极性待分析物就很难通过吸附扩散等作用接近固定相表面而发生相互作用，色谱保留能力就没有了，就是发生“相塌陷”了,也有人称之为“链折叠”或“固定相倒伏”。

图一所示：（a）是在甲醇水流动相下的碳链形状；（b）是100%水流动相下的碳链形状。

相塌陷会造成保留时间减少、保留时间没有重现性、拖尾程度增加以及梯度再生恢复时间变长等色谱性能变坏的问题。很多因素会影响保留时间减少的速率和程度，包括键合烷基链的类型、键合密度和硅胶孔径。当固定相的键合密度比较低的时候（小于3umol/m2），相塌陷不是个问题，因为残留在硅胶表面的硅醇基能使填料表面被水分子润湿，使烷基链有机会和极性待分析物中的疏水部位发生作用。当键合相是C3之类的短链烷基时，相塌陷也极少发生，因为短链烷基链的体积小，对亲水性的硅醇基的屏蔽作用不明显。

二个研究实例

Kazakevichi，LoBrutto等人系统地研究过不同的烷基链固定相的塌陷问题，他们的研究结论是：如果不考虑有机相的存在比例，烷基链处于塌陷状态是最稳定的。流动相中的各组分在固定相中聚积量实际上和烷基链的长度无关。他们观察到，当用100%水流动相低流速冲洗烷基链反相色谱柱过夜后，用尿嘧啶等出峰实际测得的死体积要低于原先预估的死体积。这归因于水的表面张力大，100%水流动相不能进入硅胶内部的小孔所致。用高含量乙腈流动相冲洗至少3小时后，原先的死体积又可以恢复。按照LapLace-Young方程，ΔP=4γCOSθ/d（这里的ΔP是流动相进入小孔需要的压力, γ是表面张力, θ是流动相和填料表面的接触角,d是孔的有效直径），液体表面张力越大，液体和固体表面亲水疏水性质相差越大（θ接触角大），小孔的有效孔径越小，流动相进入孔内部的难度就越大。

Przybyciel和Santangelo用阿莫西林（一种抗生素，极性物质）做了试验，结果见图。所用色谱柱为C8柱，初期用水乙腈流动相冲洗直至基线稳定，然后转换到0.1%的醋酸流动相（不含任何有机相），（a）图显示阿莫西林保留时间是8.6分钟；关掉泵让仪器休息10分钟，用同样的流动相并重新进样，（b）图显示保留时间只有3.5分钟了，而且峰形也变得很差。



如何使已经产生相塌陷柱子的色谱性能得到恢复?


有一点需要首先强调，相塌陷并没有根本上毁坏色谱柱，是很容易恢复的。
还是从LapLace-Young方程(ΔP=4γCOSθ/d),我们就可以自然地想到恢复相塌陷柱子性能的方案。一个是系统提供足够大的ΔP,强力将高含水流动相或100%水流动相压入硅胶的小孔内,使流动相润湿小孔,使待测物分子有机会和小孔内的疏水烷基链发生保留作用，图（c）就是Przybyciel和Santangelo对柱子加压270bar，持续10分钟后进样的恢复结果，阿莫西林的保留时间恢复到了7.8分钟，可能加压还不够大的原因，没有完全恢复到原来8.6分的保留水平；另外一个方案就是用γCOSθ值小的流动相替换高含水流动相,进入孔内对烷基固定相进行再溶剂化和重新润湿，从而恢复色谱保留能力。他们用60：40的乙腈水以1ml/min的流速冲洗已经相塌陷的C8色谱柱30分钟，然后用0.1%的醋酸流动相测定阿莫西林，图（d）显示保留能力已完全恢复到原来水平，说明水有机混合流动相表面张力低，很容易在正常仪器操作压力条件下，进入小孔润湿C8烷基链。不过，0.1%醋酸流动相如果持续流过已经恢复正常保留能力的色谱柱，随着填料小孔内残留乙腈的不断减少，相塌陷现象又会重现，保留时间又会慢慢下降。
（e）图则是两位研究者用专门设计在高含水流动相条件下应用的色谱柱做的对比图谱，保留时间7.5min，阿莫西林峰形也非常漂亮。特别的地方是，这种柱子可以在100%水流动相，在正常的操作压力下，不会发生相塌陷，能保持保留能力的稳定。


解决高含水流动相下极性物质的保留问题，固定相设计方面一般有下面几种方案：
1.选用短链烷基键合相且不对硅醇基封尾
2.选用亲水性和极性很强的封尾试剂封尾
3.对烷基链固定相进行极性基团嵌入的改造
4.选用链长更长的烷基固定相
5.选用大孔硅胶
下节内容将详细介绍这几种产品层面的解决方案。

很精彩的讲解。又学了一点知识。

好文章，静等下文

短链烷基键合相且不对硅醇基封尾


硅胶表面残留硅醇基对色谱性能的不利影响已经是众所皆知,pH5以上硅醇基离子化,离子交换作用的存在可导致碱性化合物的峰形严重拖尾。但任何事情都有正反两面，这里要着重说一下硅醇基存在的正面作用。残留硅醇基赋予了反相填料表面一定程度的极性，当仅凭烷基链不能提供足够的色谱分离选择性时，硅醇基和分析物极性部位的极性相互作用所导致的混合作用机制可以改善色谱分离效果。不过，若非严格保持键合相和残留硅醇基的比例每次一样，批与批之间的重现性很难控制。
Kasakevich等人的研究表明：C链小于4个的短链烷基相发生相塌陷的可能性很小，这种情况下起主导作用的分离机制是分析物吸附到烷基链上（而不是扩散）以及分析物和硅醇基的极性相互作用。


选用亲水性和极性很强的封尾试剂封尾


短链烷基相毕竟应用局限性很大，大部分情况还是会用到C4以上的烷基键合相，此时封尾试剂和工艺的选择就很重要。选择合适的极性或亲水性的封尾试剂，可以使填料表面容易被水润湿，充分发挥长链烷基键合相的和分析物的保留作用能力。
市场上销售的采用这种工艺的商品色谱柱已很多，如热电的Aquasil C18，Alltech的Alltima AQ-C18，YMC的Hydrosphere C18，Waters的Polaris dC18等等。月旭公司的极限系列产品中，Ultimate AQ-C18也属于此类。各个厂家具体使用什么类型的极性封尾试剂和何种键合工艺，属于商业秘密，很少有资料提及，但普遍认为这些封尾试剂的封尾作用方式和传统的封尾试剂如三甲基氯硅烷类似。

极性基团嵌入的烷基相


就是先将烷基相进行极性基团嵌入的改造后，再键合到硅胶表面上。改造的部位应该是烷基相接近硅胶表面的碳原子处。极性基团的嵌入，使烷基相在流动相中有机相比例极低时（甚至100%水流动相时）也能被水溶剂化润湿，不会发生相塌陷现象。另外极性基团嵌入在硅胶表面不远的地方，对硅醇基的屏蔽作用也十分有效，不易造成峰形拖尾。所以这种工艺只需一步工艺，将预先嵌入极性基团的烷基链键合到硅胶表面即可，省略了一般有的第二步封尾工序。因为封尾基团容易在酸性条件下水解脱落，这种无封尾工艺生产的填料就有了耐酸的特性，可以在低pH条件下使用。

尿嘧啶因为不在大多数反相柱上有保留，通常用作死体积的标定试剂。但在乙醚基嵌入的烷基固定相或者极性基团封尾过的填料，在100%水流动相条件下，尿嘧啶是有保留的，出峰时间甚至在5-氟胞嘧啶和胞嘧啶之后（见图三）。嘌啉和嘧啶等碱性物质、小分子有机酸、儿茶酚胺以及水溶性维生素的测定常常需要用高含水流动相。





最早的报道是日本的野村成功将酰氨嵌入烷基链，野村的具体嵌入工艺过程见图四所示。发展到今天市场上采用极性基团嵌入工艺的产品已经有很多，包括：Supelco的Discovery amide C16，EKA的Kromasil Amide C8，Waters的Symmetry Shield RP18，Agilent的Zorbax Bonus-RP以及Supelco的ABZ等,嵌入烷基链的极性基团包括醚基、氨基、酰基、脲基和酰胺基等不同，月旭公司也将会在不久后推出自己独有的极性基嵌入工艺的纯水柱产品。

Waters的Symmetry Shield RP18，Agilent的Zorbax Bonus-RP 这两款都用过。还不错。月旭AQ柱也是适用于纯水的，跟将推出的极性基嵌入工艺的纯水柱相比，应用上不知有什么差异。

刚好1234chen问到了，这里就顺便总结一下烷基链嵌入极性基团的纯水柱和用极性基团封尾的纯水柱相比，有哪些特点或者应用上的差异。
1.尽管嵌入了极性基团,但固定相仍然保持反相特性
2.与普通AQ纯水柱的纯粹烷基固定相比较,因为嵌入了极性基团,选择性会有不同,特别是在测定极性物质时。
3.硅醇基活性被极性基屏蔽,不易拖尾,峰形更佳。
4.因为没有进行过封尾工艺,酸性条件下应用更稳定

原文由 plexu(plexu) 发表:
刚好1234chen问到了，这里就顺便总结一下烷基链嵌入极性基团的纯水柱和用极性基团封尾的纯水柱相比，有哪些特点或者应用上的差异。
1.尽管嵌入了极性基团,但固定相仍然保持反相特性
2.与普通AQ纯水柱的纯粹烷基固定相比较,因为嵌入了极性基团,选择性会有不同,特别是在测定极性物质时。
3.硅醇基活性被极性基屏蔽,不易拖尾,峰形更佳。
4.因为没有进行过封尾工艺,酸性条件下应用更稳定

用一个应用实例来说明极性基团嵌入后选择性的不同,对一些极性物质测定选择性方面有了很大改善.




对七种三嗪类农药的分离,(a)是用极性基团嵌入的烷基固定相测定的谱图,分离度极良好,峰形也十分对称。而（b）是用普通烷基固定相测得的谱图，选择性很差，没有分开。