主题：【第二届网络原创参赛作品】有机合成液相色谱跟踪检测之我见

原文由 xky0230699(xky0230699) 发表:
有机合成液相色谱跟踪检测之我见
　　随着药典中高效液相色谱应用的增加，在有机合成跟踪检测上的作用也与日俱增，它的快速，灵敏，准确，可同时分析多组分等优点正符合跟踪需要。有机合成跟踪分析从严格性上来说，明显低于药典的相关要求（当然，成品分析是要求与药典和相关标准是一样的），检测的主要目的是反映实验的进程和副反应变化，为实验条件选择，优化提供依据。以下是本人对反相色谱法跟踪分析过程的一点总结。


一、    准备阶段
　　这一阶段的工作类似于方法开发过程。首先，要了解反应的底物（原料）和产物的结构，理化性质等，为流动相，PH，色谱柱的选择提供依据，（方法开发站内已有大量的帖子，这里不再重复说明），反应使用溶剂的性质，这个也很重要，因为溶剂经常PH是超出色谱柱的使用范围的（如胺类溶剂，酸性反应液等），且在检测条件下可能有吸收，会干扰或误导分析，要做空白溶剂对照，在不引起反应液改变的前提下，调节供试品溶液的PH。在能用反相色谱的情况下，尽量使用反相，操作简便，分析条件较容易摸索得到；第二，选择初始流动相，通常为80%甲醇-水，这一条件下，可以确定反应液所有组分的出峰时间，再以10%，5%或微调的比例调节有机相，从大到小，使之达到较佳的分离度（这一步如果有梯度泵，将带来极大的便利，几乎可以说是方法开发必备的利器）。检测波长低于220nm的，一般选择乙腈为有机相比较适合，但也要根据样品的溶解性加以综合考虑。根据峰形，分离度等，看是否需要加入调节剂，如缓冲盐（增加缓冲盐浓度常有延长保留时间的趋势，但不是很明显，当分离度在1.0-1.5之间时，或可加以运用），三乙胺，离子对试剂，四氢呋喃（作调节剂时比例常不超过10%），是否需要调节流动相的PH等，缓冲盐溶液通常为30mmonl/L的磷酸二氢钾溶液，扫尾剂常为0.5%或1%的三乙胺，或可增加两者的浓度。第三，波长的选择，由于反应液组分的复杂性与纯品的单一性不同，一般少用紫外分光光度计进行波长扫描，因为你扫描出的是多组分叠加后的吸收曲线，所以有DAD检测器是最适合的，其次是停泵扫描（见http://www.instrument.com.cn/bbs/shtml/20081011/1527048/）。我手上使用的是岛津SPD-20A的检测器，所以最常用的就是停泵扫描，此检测器有双波长检测功能，因此在第一次检测时，波长一般选择210nm（甲醇的截止波长）和254nm进行检测，此双波长下基本可以反映反应液的所有组分，确定各组分的出峰时间后，对各组分进行停泵扫描。最少扫描3次（曾遇上过假的扫描图谱），同时把扫描的吸收强度与相同时样量进色谱峰峰高对照，两者应基本一致，说明扫描正确。第四，柱温，我一般选择30℃，有需要再加以调整。

    总而言之，这一阶段的最低要求是，要尽量使所有组分均被检出，各组分比例接近于实际含量，且达到一定的分离度和柱效；其次，是峰对称性在0.8-1.5之间即可；再次，就是要在尽量短的时间内完成检测以适应跟踪需求。尽可能先了解整个合成路线，使开发的方法能适用于整个合成过程，避免采用多个分析方法，以致每次都要对相应色谱峰进行定位和不断更换流动相，平衡色谱柱造成的时间浪费。


二、    跟踪阶段
　　此阶段检测重点是观察并如实记录反应液的变化情况，如各组分峰面积的变化，组分数目的变化，保留时间的变化及其与反应条件的关系。
1、    峰面积的变化 正常情况下，应该原料峰面积减少，而产物峰面积增加。首先，原料峰的变化最容易判断，通过原料的保留时间定性和峰面积变化，就可判断原料是否有反应。其次，产物的峰面积应增加，但峰面积增加的未必就是所要的产物，也可能是副产物或中间态。可以通过以下判断：（1）最直观的表现，原料反应完全后，新出现的最大的峰往往就是产物峰；（2）反应机理 通过机理可能判断副反应进行的难易程度对峰面积的大小进行对照，如副反应很难进行，而有一色谱峰随着原料的减少而明显增加，那可能就是产物；（3）物质的极性 根据反应前后极性的变化，与原料进行比较，判断产物峰的可能位置，同时判断副产物的极性加以对照，并结合硅胶TLC的点位判断；（4）根据原料上引入基团是助色团还是减色团，与在双波长下峰面积不同的比较。（5）在原料基本反应完全后，提取，结晶出产物，以熔点，官能团鉴别来再一次确认；（7）如果有下一步反应，取产物进行下一步反应，看反应现象是否符合理论，符合，则确定反应产物正确。（7）以上方法都无法判断，可选择红外，质谱，核磁等进一步鉴别。产物确认后，以结晶后的产物返回对色谱峰进行定位。