主题:【艾杰尔专题讲座】手把手教你如何建立合适的固相萃取(SPE)方法,欢迎您来提问~

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    固相萃取,即Solid Phase Extraction,简称 SPE,是从八十年代中期开始发展起来的一项样品前处理技术。主要用于样品的分离,净化,和富集。主要目的在于降低样品基质干扰,提高检测灵敏度。

    SPE是利用选择性吸附于选择性洗脱的液相色谱分离法原理。较常用的方法是使液体样品溶液通过吸附剂,保留其中被测物质,在选择适当强度溶剂冲去杂志,然后用少量良溶剂迅速洗脱被测物质,从而达到快速分离净化与浓缩的目的。也可选择性吸附干扰杂质,而让被测物质流出;或同时吸附杂质和被测物质,再使用合适的溶剂选择性洗脱被测物质。

    本次讲座,我们主要从以下几个方面说明如何建立一个合适的SPE方法,各位网友如有什么问题,欢迎加入讨论。
                                   
固相萃取基本原理与操作

·
固相萃取吸附剂与目标化合物之间的作用机理

·p H值对固相萃取的影响
·固相萃取操作步骤及注意事项

固相萃取方法的建立与优化

·固相萃取方法的建立步骤
·固相萃取方法的优化技巧
·固相萃取小柱的选择技巧

固相技术应用实例解析

·固相萃取技术在食品分析方面的应用实例解析

·固相萃取技术在环境领域中的应用实例解析
·固相萃取技术在药物分析中的应用实例解析

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2010/6/30 15:59:24 Last edit by madprodigy 举报
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·固相萃取吸附剂与目标化合物之间的作用机理

固相萃取主要通过目标物与吸附剂之间的以下作用力来保留/吸附的

1)    疏水作用力
2)    离子交换作用
3)    物理吸附

·p H值对固相萃取的影响

      pH值可以改变目标物/吸附剂的离子化或质子化程度。对于强阳/阴离子交换柱来讲,因为吸附剂本身是完全离子化的状态,目标物必须完全离子化才可以保证其被吸附剂完全吸附保留。而目标物的离子化程度则与pH值有关。如对于弱碱性化合物来讲,其pH值必须小于其pKa值两个单位才可以保证目标物完全离子化,而对于弱酸性化合物,其pH值必须大于其pKa值两个单位才能保证其完全离子化。对于弱阴/阳离子交换柱来讲,必须要保证吸附剂完全离子化才保证目标物的完全吸附,而溶液的pH值必须满足一定的条件才能保证其完全离子化。

·固相萃取操作步骤及注意事项


针对填料保留机理的不同(填料保留目标化合物或保留杂质),操作稍有不同。

1.填料保留目标化合物

固相萃取操作一般有四步(见图1):

Ø 活化---- 除去小柱内的杂质并创造一定的溶剂环境。(注意整个过程不要使小柱干涸)
Ø 上样---- 将样品用一定的溶剂溶解,转移入柱并使组分保留在柱上。(注意流速不要过快,以1ml/min为宜)
Ø 淋洗---- 最大程度除去干扰物。(建议此过程结束后把小柱完全抽干)
Ø 洗脱---- 用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。(注意流速不要过快,以1ml/min为宜)


图1



2.填料保留杂质

固相萃取操作一般有三步(见图2):
Ø 活化--除去柱子内的杂质并创造一定的溶剂环境。(注意整个过程不要使小柱干涸)
Ø 上样--将样品转移入柱,此时大部分目标化合物会随样品基液流出,杂质被保留在柱上,故此步骤要开始收集(注意流速不要过快)
Ø 洗脱---用小体积的溶剂将组分淋洗下来并收集,合并收集液。(注意流速不要过快)

此种情况多用于食品或农残分析中去除色素


固相萃取操作步骤(填料保留杂质)

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2010/6/30 15:58:37 Last edit by madprodigy
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固相萃取方法的建立与优化

·固相萃取方法的建立步骤
·固相萃取方法的优化技巧
·固相萃取小柱的选择技巧


    固相萃取技术使用起来虽然比液液萃取简单,但建立一个固相萃取的方法并无快捷方式可走。建立固相萃取方法必须考虑与萃取过程相关的多种因素,归纳起来可从三个方面考虑:即确定萃取的目的及要求、建立初步的固相萃取方法、方法的优化。

1.确定萃取的目的及要求
--

2.初步固相萃取方法的建立

建立初步的萃取方法要考虑:

l 选择合适的SPE
l 选择合适的固相萃取方法
l
方法的优化

2.1.固相萃取柱的选择

a)      柱填料的选择
首选根据目标化合物与干扰物的差异,如极性,分子量,pka值等,选择合适的填料。



2.2 固相萃取柱规格的选择
对于反相、正相和吸附型固相萃取柱来说,被萃取样品的质量不超SPE柱填料的5%
离子交换型的固相萃取柱,必须考虑离子交换的容量。SAXSCX其吸附容量为0.2mg/g下表附SPE小柱的容量和洗脱参数

SPE柱上样容量和洗脱体积的选择



规格

最大上样量

最小洗脱体积

100mg/1mL

5mg

250µL

200mg/3mL

10mg

500µL

500mg/6mL

25mg

1.2mL

1g/6mL

50mg

2.4mL

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2010/6/30 11:36:14 Last edit by sh100800
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2.3.选择合适的固相萃取方法

固相萃取的保留机制可分为两种:

2.3.1 吸附剂(填料)保留目标化合物:绝大多数化合物应用此机制,填料保留其目标组分及少量杂质通过淋洗步骤去除吸附在柱上的少量杂质,最后选择合适的(洗脱)溶剂把目标组分洗脱下来。

根据吸附剂的保留机理可进一步分为:

(1)反相(C18,C8,CN,Phenyl,C4,C1)

  • 分析物:非极性至中等极性
  • 基质:水溶性
  • 方法:
        1.活化:通常用水溶性有机溶剂如甲醇活化,然后用水平衡
        2.淋洗:含0-50%极性溶剂的缓冲溶液淋洗杂质
        3.洗脱:极性或非极性溶剂洗脱目标物

(2)正相(Silica, Florisil,Diol,NH2
  • 分析物:中等极性到强极性
  • 基质:非极性至中等极性
  • 方法:
        1.活化:非极性有机溶剂
          2.洗脱:非极性有机溶剂


(3)阳离子交换(SCX,PRS,COOH)

      •  分析物:阳离子(碱性)化合物
      • 方法:
    1.活化:用于非极性有机溶剂中的样品时,可用样品溶剂来活化;在用于极性溶剂中的样品时,可用水溶性有机溶剂过柱后,然后用水平衡,最后再用适当pH值的缓冲溶液进行平衡。
            2.上样:样品溶液pH值要小于pKa两个单位(以保证其带电荷
            3.洗脱:洗脱溶液pH值要大于pKa
两个单位(中和分析物的电荷)

4)阴离子交换(SAX,PSA,NH2PAX/MAX
    •  分析物:阴离子(酸性)化合物
    •    方法:
          1.活化:用于非极性有机溶剂中的样品时,可用样品溶剂来活化;在用于极性溶剂中的样品时,可用水溶性有机溶剂活化后,然后用水平衡,最后再用适当pH值的缓冲溶液进行平衡。
          2.上样:样品溶液pH值要大于pKa两个单位(以保证其带电荷 )。
          3.洗脱:洗脱溶液pH值要小于pKa
两个单位(中和分析物的电荷)。

2.3.2 吸附剂(填料)保留杂质:食品中色素等杂质的去除多用此机制。填料保留杂质而不保留或只保留极少量的目标组分,所以上样后即开始收集目标组分,最后用目标物所在的溶剂进一步洗脱。合并两部分收集液。

        1.
活化:以样品所在的有机溶剂进化活化,
1-2柱管体积
        2.上样:提取液转移至柱内,并收集流出液
        3.洗脱:用样品所在的有机溶剂进一步洗脱,收集流出液。合并上样和洗脱流出液。

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2010/6/30 11:34:57 Last edit by sh100800
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3.固相萃取方法的优化

3.1.影响萃取效率的因素

1)填料(固定相)----- 核心
选择合适的SPE柱是保证理想结果的前提

2)洗脱溶剂的强度:
Ø 采用正相固定相时,溶剂强度随其极性增强而增加;
Ø 采用反相固定相时,溶剂强度随极性减弱而增强。

3pH值:
    离子交换固定相、被分析物和干扰物质的pKa各不相同。通过调节pH大小,可以使固定相带电荷,被分析物带相反电荷,而使干扰物质不带电荷;或者反过来,使固定相带电荷,干扰物质带相反电荷,而使被分析物不带电荷。

4)其他…..

3.2常见问题及解决方法


l 分析物回收率低
l 萃取重现性差
l 洗脱馏分中含有干扰物
l SPE柱流速降低或阻塞

具体解决方案如下:

1)分析物回收率低
•    未保留?
•    被淋洗?
•    未被洗脱或部分洗脱?

首先要把上样液、淋洗液、洗脱液均收集,进样分析,确定问题来源



2)重现性差





3)洗脱馏分中含有干扰物





4SPE柱流速降低或阻塞


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2010/6/30 11:43:37 Last edit by sh100800
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固相技术应用实例解析

·固相萃取技术在食品分析方面的应用实例解析

·固相萃取技术在环境领域中的应用实例解析

·固相萃取技术在药物分析中的应用实例解析

建议:每个应用领域可配1-2个实例进行介绍,被检测物质建议以常见物质为主。

1.食品领域应用

动物组织中盐酸克仑特罗等4种β-激动剂药物残留检测(Cleanert PCX, P/N: CX1506)
1.实验材料


1.1 固相萃取小柱:PCX(150mg/6mL)

1.2 四种β-激动剂药物:盐酸克仑特罗、沙丁胺醇、西马特罗、莱克多巴胺等4种β-激动剂药物

2. 试样的制备

取猪肝空白样品,经过液液萃取初步处理后,添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加
试样。

3. 净化

  依次用甲醇5mL、水5mL30mmol/L盐酸5mL润洗固相萃取小柱,将上述备用液过柱,依次用水5mL、甲醇5mL淋洗,真空抽干,用4%氨化甲醇5mL洗脱PCX小柱,收集洗脱液于具塞玻璃试管中,50下氮气吹干。在样液过柱和洗脱过程中流速控制在1mL/min左右。

4. 衍生化及检测

将上述盛有残渣的具塞玻璃试管放入50烘箱中加热片刻,除去水分后,加入甲苯100mL和双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA100mL,涡旋振荡20s,密封玻璃塞,置于80恒温烘箱中加热1小时,冷却后加入300mL甲苯,作为试样溶液,供气相色谱-质谱分析(色谱柱:DA-5MS, 30m×0.25mm×0.25µm,P/N:1525-3002)。

5. 结果

5.1 回收率实验(精密度和准确度)

将猪肝空白样品经过液液萃取初步处理后,分别添加一定量的标准溶液,配制1μg/L2μg/Lg/L10μg/L100μg/L五个浓度的试样溶液,每批次内同一浓度做5次平行实验,共4个批次(样品典型回收率色谱图见附图)。

猪肝中实验结果列表如下


5.2重复性实验(批间误差实验):

猪肝中实验结果列表如下



5.2重复性实验(批间误差实验):

猪肝中实验结果列表如下




附图:猪肝中0.5μg/L1μg/L2μg/L5μg/L10μg/L100μg/L六个浓度检测结果总离子流图(TIC)代表图谱:

猪肝+1ppb(PCX)


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2010/6/30 13:11:28 Last edit by sh100800
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鸡蛋中三聚氰胺的检测(Cleanert PCX, P/N: CX0603)

1 材料和方法


1.1 主要仪器和试剂,

色谱柱(Venusil ASB C84.6*250mm5μm,艾杰尔科技),混合型阳离子交换固相萃取柱(Cleanert PCX60mg/3mL,艾杰尔科技),12位固相萃取装置(艾杰尔科技),高效液相色谱仪;高速离心机;超声波震荡仪;涡旋混合器;分析天平(万分之一);溶剂过滤器(带0.45μm有机、水系过滤膜和真空泵);乙腈(HPLC级);三聚氰胺标准品(≥99.0%);柠檬酸(分析纯);庚烷磺酸钠(色谱级);水(二次蒸馏水以上)。

1.2  色谱条件:
色谱柱:Venusil ASB C84.6*250mm5μm
流动相:乙腈∶10mM/L柠檬酸+10mM/L庚烷磺酸钠缓冲液=7∶93pH=3.0
检测波长:240nm;流速:1mL/min;进样20μL

2 实验部分

2.1  三聚氰胺标准溶液配制:
称取三聚氰胺标样10.0mg,加流动相溶解定容至100mL,即得浓度为100mg/L的三聚氰胺标样溶液。将浓度为100mg/L的三聚氰胺标准溶液分别用水稀释成浓度为1mg/L 5mg/L 10mg/L 15mg/L 20mg/L的标准品溶液,用0.45μm滤膜过滤后进液相色谱检测。

2.2  1%三氯乙酸溶液溶液的配制
称取三氯乙酸1.00g,加水溶解定容至1000mL即得。

2.3  5%氨化甲醇的配制
准确量取5mL氨水和95mL甲醇,混匀后备用。

2.4  5%醋酸铅溶液的配制
称取5.0g醋酸铅,加水溶解定容至100mL即得。

2.5  混合型阳离子交换固相萃取柱(Cleanert PCX 60mg/3mL)的活化
Cleanert PCX 固相萃取柱,以3mL甲醇,3mL水依次过柱活化,弃去流出液,备用。

2.6  加标样本处理

将鸡蛋打开搅匀,分别称取1.00g鸡蛋样本置于10mL具塞离心管中,分别加入100mg/L三聚氰胺标样溶液10μl20μl100μl,分别得到添加浓度为1.0mg/kg2.0mg/kg10.0mg/kg的样本。

往装有上述样本的具塞离心管中分别加入10mL 1%三氯乙酸溶液,2mL 5%醋酸铅溶液,摇匀,超声20分钟,8000rpm离心10分钟,全部上清液转入活化好的混合型阳离子交换固相萃取柱(Cleanert PCX60mg/3mL),依次使用3mL水,3mL甲醇淋洗,抽干,弃去淋洗液。最后用5mL 5%的氨化甲醇洗脱V/V,接收洗脱液,50℃氮气吹干,用1mL流动相定容,0.45μm滤膜过滤后进液相色谱检测。

另取空白鸡蛋样本1.00g,不添加三聚氰胺照上述方法处理,作为空白对照样品。
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3 实验结果:

3.1 峰型与分离度

分别取鸡蛋空白样品和鸡蛋添加10ppm的样品进样,结果见图1.

1 鸡蛋空白样品和鸡蛋添加10ppm的样品图谱



由图1可见,用该方法处理,三聚氰胺峰型对称尖锐,且与杂质分离良好

3.2 精密度
分别移取浓度为1.0mg/L5.0mg/L的三聚氰胺标准溶液,分别连续进样6次,结果如表1所示。

保留时间与峰面积的稳定性数据


峰面积

423

440

438

439

437

438

436

1.461

由表1结果可见,本方法具有很好的精密度和重现性。

3.3 标准校正曲线

标准校正曲线实验数据


根据以上数据计算线性方程为:y = 87.43x - 13.67 R² = 0.999 ,相关曲线见图2

浓度与峰面积的回归曲线



结果显示,该方法在
1~20mg/kg范围内线性关系良好。

3.4 添加回收率
3 添加浓度与回收率数据


由表3可见,本方法检测鸡蛋中三聚氰胺回收率较好。

4 结论

通过上述实验可见,运用本方法测定鸡蛋中三聚氰胺,基质净化效果好,杂质干扰小,色谱峰型良好对称度高,操作简单方便,和准确度高等优点,非常适用于鸡蛋中三聚氰胺的检测。

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2010/6/30 14:37:08 Last edit by sh100800
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2.环境检测应用

水中酚类检测(Cleanert PEP, P/N: PE0603)

1 实验材料

1.1 SPE小柱:Cleanert PEP 500mg/6mL
1.2 7种酚类:苯酚,4-硝基酚,间甲酚,2-氯酚,2,4-二氯酚,2,4,6-三氯酚,五氯酚

2 实验过程

2.1.样品前处理方法

1 活化:依次用5mL甲基叔丁基醚(10:90V/V)、5mL甲醇活化富集柱、5mL去离子水活化Cleanert PEP柱,5mL/min
2 上样:1L的水样过柱,<5mL/min
3 淋洗:10mL去离子水淋洗小柱,5mL/min,然后真空抽干20min
4) 洗脱:2mL甲醇/甲基叔丁基醚(10:90V/V)分两步洗脱,收集洗脱液至尖嘴瓶中
5) 浓缩:将收集的2mL洗脱液,氮气浓缩至1mL

2.2.色谱条件

色谱柱:Venusil MP C18(4.6*150,5µm)
流动相:A1%乙酸
B1%乙酸甲醇
检测器:UV检测器
梯度洗脱程序:



1. 七种酚的色谱图

注: 1、苯酚  24-硝基酚  3、间甲酚  42-氯酚 52,4-二氯酚 62,4,6-三氯酚 7、五氯酚


三.实验结果

七种酚在水中的添加回收率见表1.

1.  七种酚类在水中的添加回收率结果


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水中硝基苯的固相萃取方法(Cleanert PEP, P/N: PE0603)

1SPE柱:Cleanert PEP500mg/6mL

2.样品制备:分析前应先调节水样pH值为中性,向每份水样中加人甲醇使甲醇浓度为0.5%。混匀。

3SPE方法:

1PEP柱活化:将 PEP柱置于固相萃取装置的针座圈上,用3mL正己烷预洗萃取柱,加人5mL甲醇,在甲醇完全流过萃取柱前加入10mL试剂水,使柱床处于湿润和活化状态。

2).样品的富集:根据水样浓度准确量取适量水样于分液漏斗中,开启固相萃取装置真空系统,使水样连续通过活化过的萃取柱保持流速不超过5mL/min进行萃取,在萃取过程中要始终保持柱床上至少有1cm高水样。当所有样品都通过萃取柱后,用10mL超纯水冲洗分液漏斗内壁,继续真空抽吸20min

3)干燥柱预处理:向带筛板的干燥管中加入5g处理过无水硫酸钠,使用前分别用10mL丙酮和正己烷,再以10mL丙酮洗以净化干燥柱

4)萃取柱的洗脱:保持管线的连接,在真空多管装置的萃取缸中放人试管架及接收管,在针座圈和萃取柱之间连接干燥柱用于脱水,用1mL丙酮过渡,弃去过柱液(该步骤不要吹干,让丙酮和柱内填料平衡2min),10mL正己烷/丙酮(90:10V/V)洗脱萃取柱,洗脱经过干燥柱(与PEP柱串联),收集流出液至接受管中,用氮吹仪在40下浓缩至1.0mL,进样分析(需要观察有无分层,水会引起分层,影响氮吹)。
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3.药物分析中的应用

血浆中油酸及其代谢物LC-MS分析中的应用(Cleanert PAX, P/N: AX0603)

1.      油酸结构



2.提取及净化方法




3.检测条件:

仪器:API Qtrap 3200, 美国Applied Biosystem公司;LC-20A高效液相色谱,日本岛津公司

质谱条件:电离子喷雾源;负离子模式检测;扫描方式为选择反应监测(MRM)方式

用于定量分析的离子反应分别为:m/z 281.2® m/z 281.2 (油酸)m/z 315.2 ® m/z 315.2(油酸代谢物)m/z 269.2® m/z 269.2 (内标C17)

流动相为:ACN: 3mmol/L ammoniµm acetate=8515

4.实验结果


1 伪麻黄碱及内标物利多卡因色谱图


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