主题：【在线讲座33期】液相色谱柱使用疑难问题解析(答疑结束）

原文由 zqy0797(zqy0797) 发表:
plexu您好！我有以下问题想请教，
　请问：同一根色谱柱在分析完三聚氰胺后，再分析苯甲酸、山梨酸、糖精钠时为什么保留时间会提前？

这个问题很有意思
三聚氰胺分析需要用到离子对，那么是不是这个离子对试剂对C18有点影响？
如果很多组分保留时间提前，那么有可能产生了相塌陷，这就需要一定要使用耐水性的色谱柱

原文由 plexu(plexu) 发表:

原文由 小卢(luxw) 发表:
这个问题我考虑过！但有个担心的问题，就是由于我们的大多检测标准时欧盟或美国药典标准，因此填料、柱长、直径都固定了，如果选择保护柱的话，还需要考虑那么多吗？

美国药典欧洲药典对填料和柱长并没有规定很死，是允许在一定范围内调整的，加保护柱肯定不违反药典的规定。

前面讲了一些欧洲药典的规定，后面可以再看看美国药典的规定

Adjustments to the Chromatographic System

As mentioned, <621> allows a number of adjustments to the chromatographic system in response to issues with a procedure's system suitability. These are the maximum allowable variations unless the individual monograph directs otherwise.

Ratio of components in mobile phase: Although the replacement of any solvent in the mobile phase constitutes a change and not an adjustment, the amounts of the minor components (specified as 50% or less) in the mobile phase can be adjusted up to ±30% relative to the particular component. However, the change in any component cannot exceed ±10% absolute (that is, in relation to the total mobile phase). Adjustments can be made to one minor component in a ternary mixture.

pH of mobile phase: The pH of the aqueous buffer used in the preparation of the mobile phase can be adjusted to within ±0.2 units of the value or range specified.

Column temperature: The column temperature can be adjusted by as much as ±10 °C.

Concentration of salts in buffer: The concentration of the salts used in the preparation of the aqueous buffer for the mobile phase can be adjusted up to ±10% relative to the particular component, provided the permitted pH variation (see above) is met.

Wavelength of UV–vis detector: Deviations from the wavelengths specified in the method are not permitted.

Stationary phase:

• Column length: The column length can be adjusted by as much as ±70%.
• Column inner diameter: The column inner diameter can be adjusted, provided that the linear velocity is kept constant (see Flow Rate).

Flow rate: When column dimensions have been modified, the flow rate can be adjusted using the following formula:

where

F₁ is the flow rate indicated in the monograph, in milliliters per minute;

F₂ is the adjusted flow rate, in milliliters per minute;

l₁ is the length of the column indicated in the monograph;

l₂ is the length of the column used;

d₁ is the column inner diameter indicated in the monograph; and

d₂ is the internal diameter of the column used.

Additionally, the flow rate can be adjusted by ±50% (2).

Injection volume: The injection volume can be reduced as far as is consistent with accepted precision and detection limits, but no increase is permitted.

Particle size: Particle size can be reduced by as much as 50% but cannot be increased.


Column Dimensions: Inner Diameter, Length

The chromatographic purity test included in the hydroxyzine hydrochloride monograph (8) required the use of two 10 cm × 3 mm columns coupled in series and containing packing L3 with a flow rate of 0.4 mL/min. It would be advantageous to use one column with standard dimensions of 4.6 mm i.d. and a 25-cm length. Chapter <621> allows the simultaneous change of column inner diameter and length and recommends the flow rate be adjusted according to equation 1 given earlier.

The new flow rate calculated using the formula is 1.2 mL/min. When a flow rate of 1.0 mL/min was used with a 4.6-mm i.d. and 25-cm length column, the observed resolution was greater than 3. The current official monograph includes the revised column dimensions of 4.6-mm i.d. and 25-cm length and flow rate of 1.0 mL/min

原文由 yongzhbenq(yongzhbenq) 发表:

原文由 zqy0797(zqy0797) 发表:
plexu您好！我有以下问题想请教，
　请问：同一根色谱柱在分析完三聚氰胺后，再分析苯甲酸、山梨酸、糖精钠时为什么保留时间会提前？

这个问题很有意思
三聚氰胺分析需要用到离子对，那么是不是这个离子对试剂对C18有点影响？
如果很多组分保留时间提前，那么有可能产生了相塌陷，这就需要一定要使用耐水性的色谱柱

知道为什么保留时间会提前吧。是因为柱子里面有杂质及一些较难洗脱的强保留成分，它们和硅羟基结合占据了过多的结合位点，导致目标组分和柱子的结合就弱了，所以保留时间提前了

原文由 plexu(plexu) 发表:

原文由 xue2009(xue2009) 发表:

原文由 xieqinqin(xieqinqin) 发表:
plexu您好！我有以下问题想请教，
请问：用的是四元梯度泵  A50%甲醇 B50% 水  经常出现停 或进气泡  这是什么原因？

这个比例下因为使得流动相黏度最大，所以最容易产生气泡了，一般我们设计洗脱程序都避开这个比例。

水/甲醇比例在55：45时，黏度和柱压有个极大值。50：50接近了这个极值，柱压是比较高的，但影响柱压最大的还是填料粒径和色谱柱内径，你这个实例中不知用的什么规格的色谱柱？系统压力高，可能会因溶剂泵中的过滤头供液速度跟不上而导致气泡进入系统，停机也应该是因为气泡进入压力下降的原因，可考虑更换液体通量更大的过滤头。

请问plexu“但影响柱压最大的还是填料粒径和色谱柱内径”这句话怎么解释？是不是根据那个柱压公式看的，我有点模糊，谢啦。

原文由 zqy0797(zqy0797) 发表:
plexu您好！我有以下问题想请教，
　请问：同一根色谱柱在分析完三聚氰胺后，再分析苯甲酸、山梨酸、糖精钠时为什么保留时间会提前？

色谱柱被强保留物质污染后，保留时间提前和滞后的情况都有，具体要看污染物的性质，还要看分析物、固定相和污染物三者共同作用的情况，情况比较复杂，有时候比较难预测是提前还是滞后。不过你平时维护的时候，注意在测定后将污染物用有机溶剂反冲清洗，就可以减轻或避免这种情况的出现。建议每个分析方法用专门的色谱柱，长远看，这样更节省色谱柱的费用。

原文由 yongzhbenq(yongzhbenq) 发表:

原文由 zqy0797(zqy0797) 发表:
plexu您好！我有以下问题想请教，
　请问：同一根色谱柱在分析完三聚氰胺后，再分析苯甲酸、山梨酸、糖精钠时为什么保留时间会提前？

这个问题很有意思
三聚氰胺分析需要用到离子对，那么是不是这个离子对试剂对C18有点影响？
如果很多组分保留时间提前，那么有可能产生了相塌陷，这就需要一定要使用耐水性的色谱柱

测定苯甲酸等，水相比例很大，发生相塌陷导致保留时间降低情况是存在的。不过这和前面分析过三聚氰胺没关，另外如果发生相塌陷，保留时间会越来越提前，严重的会失去保留能力。

原文由 xue2009(xue2009) 发表:

原文由 plexu(plexu) 发表:

原文由 xue2009(xue2009) 发表:

原文由 xieqinqin(xieqinqin) 发表:
plexu您好！我有以下问题想请教，
请问：用的是四元梯度泵  A50%甲醇 B50% 水  经常出现停 或进气泡  这是什么原因？

这个比例下因为使得流动相黏度最大，所以最容易产生气泡了，一般我们设计洗脱程序都避开这个比例。

水/甲醇比例在55：45时，黏度和柱压有个极大值。50：50接近了这个极值，柱压是比较高的，但影响柱压最大的还是填料粒径和色谱柱内径，你这个实例中不知用的什么规格的色谱柱？系统压力高，可能会因溶剂泵中的过滤头供液速度跟不上而导致气泡进入系统，停机也应该是因为气泡进入压力下降的原因，可考虑更换液体通量更大的过滤头。

请问plexu“但影响柱压最大的还是填料粒径和色谱柱内径”这句话怎么解释？是不是根据那个柱压公式看的，我有点模糊，谢啦。

对啊，如果限定了色谱柱规格，柱压和黏度和流量关系最大。对不同规格的色谱柱，填料粒径小的色谱柱，柱压要成二次方的反比例上升。对1.7um填料，柱压达到60-100mpa也很正常。

plexu您好！我有以下问题想请教，
请问：HPLC柱前衍生和柱后衍生的相关问题？
1、为什么要衍生？
2、衍生化的分类？
3、进行衍生，适用的化合物有哪些？
4、进行衍生化的要求有哪些？
5、柱前衍生和柱后衍生的优缺点？

plexu您好！我有以下问题想请教:

请问：

1 多个样品不好不离的时候，请问该怎么通过选择合适的柱子来提高分离度？

2 苯基柱，氰基柱该什么时候考虑用？

3 同样类型柱子还有长度，粒径等差异，这些该怎么去选择？

  请赐教，非常感谢！

原文由 xyhdcm2002(xyhdcm2002) 发表:
plexu您好！我有以下问题想请教，
请问：HPLC柱前衍生和柱后衍生的相关问题？
1、为什么要衍生？
2、衍生化的分类？
3、进行衍生，适用的化合物有哪些？
4、进行衍生化的要求有哪些？
5、柱前衍生和柱后衍生的优缺点？

问题有些多，先回答前2个。
色谱技术中的化学衍生法系指在色谱过程中用特殊的化学试剂（一般称为衍生化试剂或标记试剂）使样品成分转变相应的衍生物之后进行分离检测或进行检测的方法。目的为：1．将紫外—可见强吸收功能基团引入被检测对象或将其转变为荧光衍生物，以提高检测灵敏度；2提高对分析样品的分离和选择性。


从是否与HPLC系统联机的角度，化学衍生法分为在线on line）与离线∣Off line）两种。从发生衍生化的场合，分为柱前衍生法pre-column derivatization）与柱后衍生法（post-column derivatization）两种。目前，在HPLC中，以离线的柱前衍生法（简称柱前衍生法）与在线的柱后衍生法（简称柱后衍生法）使用居多。