第五章增加PCR特异性

引物设计
细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点：
* 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
* 选择GC含量为40％到60％或GC含量反映模板GC含量的引物。
* 设计5'端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。
* 避免引物对3'末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。
* 避免3'末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。
* 避免3'末端的错误配对。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。
* 避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。
目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5'端而不影响特异性。当计算引物Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。有时候，仅有有限的序列信箱可供用于引物设计。比如，如果仅知道氨基酸序列，可以设计简并引物。简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。不要在引物的3'端使用简并碱基，因为3'端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。使用较高的引物浓度（1μM到3μM），因为许多简并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。
引物退火温度
引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。表5列出确定引物Tm最常用的两种方法。第一个公式来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。第二个公式根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。
表5. 估算Tm的公式

根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃，就会由于在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃。或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后再根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严谨的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
递减PCR
递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1℃到2℃，直到退火温度低于Tm5℃。只有同同源性最高的目的模板会被扩增。这些产物在随后的循环中继续扩增，并会将扩增的非特异性产物排挤出去。递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法较为有用，如AFLP DNA指纹分析。
引物浓度
引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。为了确定引物浓度，可以在260nm（OD260）测量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系数的倒数（nmol/OD），通过Beers法则（公式1）计算引物浓度。微摩消光系数可以使用公式2计算。与大分子双链DNA可以使用平均消光系数不同，确定引物的精确浓度必须使用计算的消光系数。这是因为引物较短，碱基组成差异很大。在Gibco/BRL定制引物的质检报告中包含了消光系数（OD/μmol）和消光系数的倒数（μmol/OD）。另外，不要使用寡聚核苷酸作为标准，在EB染色的胶上估算引物浓度，因为引物和标准的染色能力根据序列不同而差异很大。
公式1

公式2

引物纯度和稳定性
定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的（表6）。使用Invitrogen™Parallel Array Synthesis™技术，不必除盐。同其他方法相比，在Parallel Array Synthesis™技术中，通过脱盐而除去的苯甲酰基和异丁酰基很少，因此不会干扰PCR。部分应用需要纯化，以除去在合成过程中的任何非全长序列。这些截断序列的产生是因为DNA合成化学的效率不是100％。这是个循环过程，在每个碱基加入时使用重复化学反应，使DNA从3'到5'合成。在任何一个循环都可能失败。较长的引物，尤其是大于50个碱基，截断序列的比例很大，可能需要纯化。
表6. 用于PCR应用的引物最低建议纯度
Application Minimum Suggested Purity

PCR Standard

First-strand cDNA synthesis for RT-PCR Standard

AFLP® technology Standard

PCR using primers with 5' sequences
(restriction endonuclease sites,RNApolymerase promoter sites,etc) Cartridge

PCR primers > 50bases PAGE

Cycle sequencing Standard

Isothermal sequencing Desalted

Site-directed mutagenesis Cartridge

CFLP™ techmology Desalted
引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。Invitrogen?以一个最小OD单位确保总寡核苷的产量（表7）。定制引物以干粉形式运输。最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100μM。TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。
表7. 各种纯化方法的最低寡核苷酸产量
Minimum Yield(OD) for Different Primer Purities*

Number of Bases Synthesis Scale Standard/Desalted CartridgeHPLC PAGE

大于20 50nmole 2 2 NA NA

200nmole 8 8 3 1

1µmol 20 20 10 3

10µmol 200 NA 100 30

大于等于20 50nmole 5 2 NA NA

200nmole 20 10 3 1

1µmol 50 25 15 5

10µmol 500 NA 150 50

Note:For primers > 50 bases, PAGE purification is recommended and HPLC isnot an option.

NA is not available.

*These Yields are seen with the following 5' modifications: biotin,fluorescein(FITC), rhodamine, primary amines(NH2), phosphate(PO4), HEX, TET,FAM, and phosphorothioates(S-Oligos), Other modifications may have slightlylower yields.
引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。以大于10μM浓度溶于TE的引物在-20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存2个月。
热启动
热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如定点突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。
限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。这种方法简单便宜，但并不能完全抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。
热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。包括延缓加入Taq DNA聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其是对高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，如镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。
Platinum DNA聚合酶对于自动热启动PCR来说方便高效（图20）。Platinum Taq DNA聚合酶的成分为复合有抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体的重组TaqDNA聚合酶。抗体在PCR配制以及在室温的延时保温过程中抑制酶的活性。Taq DNA聚合酶在变性步骤的94℃保温过程中被释放到反应中，恢复了完全的聚合酶活性。同经化学修饰用于热启动的Taq DNA聚合酶相比，Platinum酶不需要在94℃延时保温（10到15分钟）以激活聚合酶。使用PlatinumTaq DNA聚合酶，在94℃进行2分钟就可以恢复90％的TaqDNA聚合酶活性。

图20. 使用Platinum® Taq DNA聚合酶增加特异性
A组. 人基因组DNA内克隆的HIVDNA的检测。带有HIV gag区域的1000个质粒DNA拷贝同100ng的基因组DNA混合，使用gag区域的引物进行扩增。泳道1. 使用TaqDNA聚合酶，在室温配制反应液。泳道2. 使用Taq DNA聚合酶，通过在94℃加入酶而手工热启动。泳道3. 使用PlatinumTaq DNA聚合酶，在室温配制反应液。B组. 由100ng人基因组DNA扩增4.1kb的人β-球蛋白。泳道1. 使用TaqDNA聚合酶，在室温配制反应液。泳道2. 使用Taq DNA聚合酶，在冰上配制反应液并放置在预热（80℃）的PCR仪。泳道3. 使用PlatinumTaq DNA聚合酶，在室温配制反应液。
镁离子浓度
镁离子影响PCR的多个方面，如DNA聚合酶的活性，这会影响产量；再如引物退火，这会影响特异性。dNTP和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含200μM dNTP的典型PCR起始浓度是1.5mM（注意：对实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液）。较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性。为了确定最佳浓度，从1mM到3mM，以0.5mM递增，进行镁离子滴定。为减少对镁离子优化的依赖，可以使用Platinum Taq DNA聚合酶。Platinum Taq DNA聚合酶能够在比TaqDNA聚合酶更广的镁离子浓度范围内保持功能，因此仅需较少的优化（图21）。

图21. 使用Platinum® Taq DNA聚合酶拓宽镁离子浓度范围
由100ng人基因组DNA扩增人β-球蛋白基因的2.8kb区域。A组，使用TaqDNA聚合酶，在冰上配制反应液并放置在预热（80℃）的PCR仪。B组，使用PlatinumTaq DNA聚合酶，在室温配制反应液。
促进PCR的添加剂
退火温度，引物设计和镁离子浓度的优化足以对大多数模板进行高特异性的扩增，但是，某些模板，包括高GC含量的模板，需要其他的措施。影响DNA熔解温度的添加剂提供了提高产物特异性和产量的另外一种方法（图22）。为获得最好的结果需要模板的完全变性。另外，二级结构会阻止引物结合和酶的延伸。PCR添加剂，包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱以及PCRxEnhancer Solution可以增强扩增。它们可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。PCRxSolution还有其他优点。在同Platinum Taq DNA聚合酶（图22）和Platinum Pfx DNA聚合酶一起使用时，基本上不需要优化镁离子浓度。这样，将Platinum技术同添加剂结合，增强了特异性，同时减少了第三种方法-镁离子优化的依赖。为获得最佳结果，应优化添加剂的浓度（图23），尤其是会抑制TaqDNA聚合酶的DMSO，甲酰胺和甘油。

图22. 使用PCRx Enhancer Solution提高特异性
使用Platinum® Taq DNA聚合酶，由100ng人基因组DNA扩增一条156bp的片段（GC含量62％）。使用标准PCR缓冲液（A组）或带有1×PCRxEnhancer Solution的PCRx Amplificaton Buufer（B组），测试不同的MgCl2浓度（泳道1到4分别为1.0，1.5，2.0，2.5mM）。循环在94℃ 30秒，60℃ 30秒，68℃ 1分钟进行35个循环。

图23.测试PCRx Enhancer Solution的不同浓度
在带有不同量PCRx Enhancer Solution（0到4×）的1×PCRxAmplificaton Buufer中，使用Platinum® Taq DNA聚合酶，对包含三核苷重复的149bp序列（GC含量78％）进行扩增。
巢式PCR
使用巢式引物进行连续多轮扩增可以提高特异性和灵敏度。第一轮是15到20个循环的标准扩增。将一小部分起始扩增产物稀释100到1000倍加入到第二轮扩增中进行15到20个循环。或者，也可以通过凝胶纯化将起始扩增产物进行大小选择。在第二轮扩增中使用一套巢式引物，其可以同第一套引物内侧的靶序列结合。巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同两套引物都互补的靶序列很少。而使用同样的引物对进行总数相同的循环（30到40）会扩增非特异性靶位点。巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5'RACE）的特异性。

模板质量
模板的质量会影响产量。DNA样品中发现有多种污染物会抑制PCR。一些在标准基因组DNA制备中使用的试剂，如SDS，在浓度低至0.01％时就会抑制扩增反应。分离基因组DNA较新的方法包括了DNAZol，一种胍去垢剂裂解液，以及FTA Gene Guard System，其可以同基质结合，在血液及其他生物样品中纯化贮存DNA（表8）。
表8. 基因组DNA分离方法
Method Description

Proteinase K/phenol extraction Classic method

DNAzol® Reagents Fast, phenol-free DNA isolation
模板浓度
起始模板的量对于获得高产量很重要。对大多数扩增满意，104到106个起始目的分子就足以在溴化乙锭染色胶上观察到。所需的最佳模板量取决于基因组的大小（表9）。举例说，100ng到1μg的人类基因组DNA，相当于3×104到3×105个分子，对于足以检测到单拷贝基因的PCR产物。质粒DNA比较小，因此加入到PCR中的DNA的量是pg级的。
表9. 基因组大小和分子数目的比例
Genonic DNA Size(bp)* Target Molecules/µg of Genomic DNA Amountof DNA(µg) for -10^5 Molecules

E. coli 4.7×10^6 1.8×10^8 0.001

Saccharomyces cerevisiae 2.0×10^7 4.5×10^7 0.01

Arabidopsis thaliana 7.0×10^7 1.3×10^7 0.01

Drosophila melanogaster 1.6×10^8 6.6×10^5 0.5

Homo sapiens 2.8×10^9 3.2×10^5 1.0

Xenopus laevis 2.9×10^9 3.1×10^5 1.0

1.0Mus musculus 3.3×10^9 2.7×10^5 1.0

Zea mays 1.5×10^10 6.0×10^4 2.0

pUC 18 plasmid DNA 2.69×10^3 3.4×10^11 1×10^(-6)

*Haploid genome size
酶的选择
除了使用高质量模板DNA，聚合酶的选择也会影响产量（见第十三章，PCR聚合酶的比较）。Platinum聚合酶比其他聚合酶产量高，因为它防止了PCR反应配制过程中的非特异性扩增（图24）。对长片段（最大到12kb）的高灵敏度PCR，应选择酶混合物，最好是Platinum形式，如Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity。这种酶结合了Platinum技术和酶混合物（Taq DNA聚合酶同带有校正功能的聚合酶混合物）的优点。