一、项目介绍

“皮革奶”是用皮革水解蛋白生产出来的乳制品，皮革水解蛋白是由皮革废料或动物皮毛、脏器等水解生成的一种蛋白粉，严格来讲“皮革水解蛋白粉”对人体健康并无伤害，不过其前提条件是所用皮革必须是未经糅制、染色等人工加工处理过的；然而这样的“皮革水解蛋白粉”是不存在的，因为经过糅制、染色等人工加工处理过的皮革比直接制作成“蛋白粉”利润要高得多，因而“皮革水解蛋白粉”多用皮革厂制作服装、皮鞋后的下脚料来生产，自然这种“蛋白粉”中混进了大量皮革糅制、染色过程中添加进来的重铬酸钾和重铬酸钠等有毒物质，如果长期食用含有“皮革水解蛋白粉”的食物，“铬”重金属离子便会被人体吸收、积累、中毒，使人体关节疏松肿大，甚至造成儿童死亡。

现乳与乳制品原料企业有将这种蛋白粉掺入乳与乳制品中以提高蛋白质的含量，严重危害到人类的身体健康，对于乳与乳制品中这种蛋白粉的鉴定，主要是通过对L-羟脯氨酸含量的测定。L‐羟脯氨酸是胶原蛋白（皮革水解蛋白）特有的氨基酸，而牛奶中并不含此氨基酸，所以一旦检出含有L‐羟脯氨酸，则可认为含有皮革水解蛋白，即为“皮革奶”，以此来监测乳与乳制品中伪劣蛋白的含量。本实验室以异硫氰酸苯酯为衍生试剂，利用紫外检测器检测，该仪器配置简单、操作方便、实用性强，非常适用于奶制品中“L‐羟脯氨酸”的测定。

二、仪器配置方案：

LC-P310高压恒流泵：2台
LC-UV310紫外检测器：1台
高压混合器（1500ul）：1台
LC-CO310 柱温箱：1台
LC-310工作站（带采样功能）：1套
7725i手动进样阀：1套
液相色谱柱：C18色谱柱（4.6mm*250mm，5um）：1支
L-羟脯氨酸（纯度≥90.0%）：1支。

三、实验方法：

样品前处理：

水解过程——准确称取0.2000g样品置于20-30mL安瓿瓶中，加入10mL含0.1%苯酚的6mol/L盐酸, 振摇使样品溶解或使样品均匀分散于溶液中，将安瓿瓶置-20℃冰箱中冷冻3～5min，充氮后用喷灯熔封，然后置110±1℃烘箱中水解24小时, 取出冷却，打开安瓿瓶，用超纯水将水解液全部转移至蒸发皿中，70℃下用氮气吹至近干，用0.1mol/L HCl水溶液定容至25mL的容量瓶中，混匀, 供衍生使用。

衍生过程——准确量取样品溶液200μl，置2ml的样品瓶中，加入三乙胺乙腈溶液100µl，异硫氰酸苯酯乙腈溶液100µl，混匀，室温放置1小时，然后加入正己烷400µl，振摇后放置10分钟，取下层溶液，用0.45µm过滤头过滤。另准确量取10ppm L-羟脯氨酸标准溶液200µl，置2ml样品瓶中，加入三乙胺乙腈溶液100µl，异硫氰酸苯酯乙腈溶液100µl，混匀，室温放置1小时，然后加入正己烷400µl，振摇后放置10分钟，取下层溶液，用0.45µm过滤头过滤，待测。

标准品的配置：

将100mg的L-羟脯氨酸标准物质用0.1mol/L HCl水溶液全部转移出并定容至100ml的棕色容量瓶中，得到浓度为1000ppm的储备溶液，使用时再用0.1mol/L HCl水溶液配置成10ppm的工作溶液。(标准溶液在4℃可保存2个月，在-20℃下可保存6个月)。

注：1、0.1mol/L盐酸溶液：量取8.5mL浓盐酸，加去离子水稀释至1000mL，混匀。

2、三乙胺乙腈溶液：取三乙胺1.4ml，用乙腈定容至10ml的容量瓶中，混匀。

3、异硫氰酸苯酯乙腈溶液：取异硫氰酸苯酯1瓶，加乙腈2mL，混匀。

4、6mol/L盐酸(含0.1%苯酚)：称取苯酚100mg，加浓盐酸50mL和去离子水50mL溶解，混匀。

5、异硫氰酸苯酯乙腈溶液：取异硫氰酸苯酯1瓶，加乙腈2mL，混匀。

四、实验谱图及验证数据：

1、L-羟脯氨酸标样谱图：