主题:【分享】二次制备,真的很神奇!(图文并茂的)

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yuhou_xiexie
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该帖子已被amandali设置为精华;
今天,在老师傅的带领下,见证了一把神奇的二次制备。我来叙述一下:
样品:未知,我们这里的样品,大部分都是不告诉你任何结构信息的。
溶解:取样品120mg用甲醇3ml溶解(客户给的)
第一次制备


色谱柱:Venusil PrepG C18, 10μm 100Å 21.2*250mm

流动相: A pH3.3 磷酸二氢钾缓冲液  B 乙腈(这是有盐的!)

流速:18ml/min

检测波长:225nm 280nm(可以设双波长)

上样量:1ml(40mg)(这个上样量还可以)

仪器:CHEETAH高压一体机
梯度设置:


44.5min处的峰是要的,接收,浓缩,纯吗?当然不纯了,不然怎么会有二次制备!
接着换系统:
另一台仪器,嘿嘿,我们这好几台仪器呢。


二次制备色谱条件:

色谱柱:Venusil Hilic 5μm 100Å 10*250mm

流动相: A 0.1%乙酸铵 B 乙腈

时间

A

B

0

10

90

20

50

50



流速:4ml/min

检测波长:225nm

柱温:35

上样量:上针浓缩到1ml,全进
仪器:Agala P1100
上制备图

神奇,两个峰,就是这么神,分离度3.8!
分别接收后,浓缩测定纯度


液相分析条件:

色谱柱:Venusil XBP C18 5μm 100Å 4.6*250mm

流动相: A pH3.3磷酸二氢钾缓冲液 B 乙腈

时间

A

B

0

90

10

30

45

55

45

45

55



流速:1ml/min

检测波长:225nm

上样量:10μl

柱温:35

仪器:Agela P1010
第一个峰的检测

第二个峰检测

保留时间接近啊!会不会就是一个物质分叉了呢?值的怀疑,上质谱验证一下。且慢!第一次制备可是加了不挥发的盐的,质谱上能打出东西吗?
老师傅说了,第二次制备的时候,捎带着就脱盐了,有点不信,试试看。
第一个峰

第二个峰
真的是两个不同的东西!

貌似很不好分离的东西,一个下午就弄出来了,虽然只有10mg,但打个核磁也够了。
特分享给众位。

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saiyin
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yhzp0801
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要都是这样,那实验室纯化的效率就太高了~~
呵呵
chromkiller
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身边有人问我楼主在说什么,我站住来得瑟一下:
1、哥们第一次用反相,没分开,流动线还加盐了,这个盐如果浓缩完了就是新的杂质。对不?
2、哥们又把第一次反相制备的东西收集了,其实这是一个混合物(2组分的),是吧?
3、LZ又用了HILIC色谱来分前面的2组分混合物(宣传你们家的材料的吧,你们的论坛,你们咋说都行),与反相的保留机理不同,整开了。
4、盐,磷酸盐,不保留,在死时间就流出了,所以顺道除盐了。

拍一个砖:如果是长链的离子对试剂,如SDS,LZ你咋办?

suiniubei
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身边有人问我楼主在说什么,我站住来得瑟一下:
1、哥们第一次用反相,没分开,流动线还加盐了,这个盐如果浓缩完了就是新的杂质。对不?
2、哥们又把第一次反相制备的东西收集了,其实这是一个混合物(2组分的),是吧?
3、LZ又用了HILIC色谱来分前面的2组分混合物(宣传你们家的材料的吧,你们的论坛,你们咋说都行),与反相的保留机理不同,整开了。
4、盐,磷酸盐,不保留,在死时间就流出了,所以顺道除盐了。

拍一个砖:如果是长链的离子对试剂,如SDS,LZ你咋办?



 这个解释比较好。易懂。

 楼主有点神吹。
tangtang
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xiongbb
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1、哥们第一次用反相,没分开,流动线还加盐了,这个盐如果浓缩完了就是新的杂质。对不?
2、哥们又把第一次反相制备的东西收集了,其实这是一个混合物(2组分的),是吧?
3、LZ又用了HILIC色谱来分前面的2组分混合物(宣传你们家的材料的吧,你们的论坛,你们咋说都行),与反相的保留机理不同,整开了。
4、盐,磷酸盐,不保留,在死时间就流出了,所以顺道除盐了。

拍一个砖:如果是长链的离子对试剂,如SDS,LZ你咋办?

首先我没看懂楼主的帖子,因为不是很懂制备,我先来结砖呀,如果使用sds,可以不可以选择甲醇沉淀一下呢?

顺便在丢一砖,lz用的第一根柱子是10μ,第二次是5μ,第二根柱子分离度3.8, 是不是如果第一根柱子选择了5μ的柱子,样品就分开了呢? 至于填料可以选择hilic的5μ呢?貌似用的仪器也不同,哪个仪器犀利呢,拉出来溜溜
binbao
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建议铁柱总结一下,得出个简单明了的结论,好让我们这些做制备做的少的人学习学习
yuhou_xiexie
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身边有人问我楼主在说什么,我站住来得瑟一下:
1、哥们第一次用反相,没分开,流动线还加盐了,这个盐如果浓缩完了就是新的杂质。对不?
2、哥们又把第一次反相制备的东西收集了,其实这是一个混合物(2组分的),是吧?
3、LZ又用了HILIC色谱来分前面的2组分混合物(宣传你们家的材料的吧,你们的论坛,你们咋说都行),与反相的保留机理不同,整开了。
4、盐,磷酸盐,不保留,在死时间就流出了,所以顺道除盐了。

拍一个砖:如果是长链的离子对试剂,如SDS,LZ你咋办?



感谢哥们提出这么尖锐的问题。

1.流动相不挥发的话,浓缩完就是新的杂质,没错。
2.对,其实至少是三个杂质,还有缓冲盐;
3.HILIC的材料的确很好用的,可以试试,不是吹的;HILIC不但与反相的机理不同,与正相的机理也不同的;离子交换?有一点点,但不全是,具体,哥们搞不明白。
4.这个问题提的好,SDS或者辛烷磺酸钠,尽量不要用,如果非要用,HILIC 也可以试试;不行的话,就上阴离子交换了;
呵呵,哥们才疏学浅,瞎说了。
该帖子作者被版主 amandali5积分, 2经验,加分理由:深层次讨论,有帮助!
yuhou_xiexie
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身边有人问我楼主在说什么,我站住来得瑟一下:
1、哥们第一次用反相,没分开,流动线还加盐了,这个盐如果浓缩完了就是新的杂质。对不?
2、哥们又把第一次反相制备的东西收集了,其实这是一个混合物(2组分的),是吧?
3、LZ又用了HILIC色谱来分前面的2组分混合物(宣传你们家的材料的吧,你们的论坛,你们咋说都行),与反相的保留机理不同,整开了。
4、盐,磷酸盐,不保留,在死时间就流出了,所以顺道除盐了。

拍一个砖:如果是长链的离子对试剂,如SDS,LZ你咋办?



 这个解释比较好。易懂。

 楼主有点神吹。


没有神吹,只是做得少,自我感觉很神奇罢了。
yuhou_xiexie
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原文由 tangtang(tangtang) 发表:

不管神不神奇,提供了一种分离的方法。


对,也在不断摸索中。
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