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主题：【原创】新型、快速、低成本SPE法检测黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1

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微雨燕双飞

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发表于：2012/01/12 14:27:02 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

2011年岁末，国家质检总局公布了液体乳产品质量国家监督抽查结果，蒙牛乳业（眉山）有限公司和福建长富乳品有限公司各1个批次产品中黄曲霉毒素M1超标，引发公众广泛关注。一时间，黄曲霉毒素的检测成为当务之急，各个检测机构加班加点检测各种可能出现黄曲霉毒素超标的产品；各个色谱产品，消耗品供应商纷纷发布相关的解决方案，忙的不亦乐乎

根据国标的规定：黄曲霉毒素的检测通常使用免疫亲和层析净化高效液相色谱法和酶联免疫吸附法（ELISA）这两种方法。估计这一事件让免疫亲和柱的供应商着实忙到下订单到手软。

回过头来我们来说说这两种黄曲霉毒素检测国标方法，酶联免疫吸附法（ELISA）操作简单，快速，但灵敏度低且会出现假阳性，需使用免疫亲和柱法进行精确定性、定量，而免疫亲和柱又存在使用繁琐、价格昂贵、储存条件苛刻、保存期短等缺点。如何找到一种既快速，简便，又低成本的检测方案成为我们技术部各位精英的努力方向。

2012年初，刚刚从新年的欢乐气氛中抽离出来，迪马技术部即投入到开发新的固相萃取法检测黄曲霉毒素的攻关任务中，经过几个昼夜的努力，ProElut SPE法检测黄曲霉毒素M1及黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1的解决方案精彩呈现。

迪马科技当然也不会忘记一直关心支持这我们的广大版友，这不我放下手头的其他事情，第一时间将这新鲜出炉的新型、快速、低成本SPE法检测黄曲霉毒素的解决方案与大家分享，算是一份稍晚的新年礼物吧。该方法可实现与免疫亲和柱法相当的高精度回收率结果，但使用成本却大大降低。ProElut^TM固相萃取法单个样品的检测成本为免疫亲和柱法的1/4，酶联免疫法的1/2，同时ProElut^TM固相萃取法简单易操作、不需要专用的大型设备、对操作人员要求不高，特别适用于各种食品生产企业及检测机构，将大大降低黄曲霉毒素的检测成本。还请大家笑纳呀

乳制品中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁的检测

1 适用范围

适用于牛奶、奶粉等乳制品中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁的检测。

2 样品准备/提取

2.1 牛奶、原料乳等液态奶制品

(1) 称取2 g样品，加入2 mL乙腈，涡旋混合1 min；

(2) 再加入4 mL乙腈，涡旋混合1 min，4000rpm，离心5 min；

(3) 取上清液4 mL，作为上样液待净化。

2.2 奶粉等固体奶制品

(1) 称取2 g样品，加入5mL水，涡旋混合2min，样品与水充分混匀；

(2) 加入5 mL乙腈，涡旋混合1 min；

(3) 再加入10 mL乙腈，涡旋混合1 min，4000rpm，离心5 min；

(4) 取上清液5 mL，作为上样液待净化。

3 SPE柱净化——ProElut^TM AFT 黄曲霉毒素检测专用柱1500 mg/12 mL（Cat.#65904）

(1)活化：	10 mL乙腈，流出液弃去；
(2)上样：	将上样液加入柱中（流速控制每滴/两秒），接收流出液；
(3)洗脱：	10 mL乙腈洗脱（流速控制每滴/两秒），收集流出液。合并步骤（2）、（3）流出液；
(4)重新溶解：	在40℃下用减压蒸馏将流出液浓缩至大约2 mL，向旋蒸瓶中加入5 mL无水乙醇，继续减压蒸馏完全干燥；
(5)衍生：	依次加入0.5 mL正己烷和0.5 mL三氟乙酸，旋好玻璃塞充分混匀衍生液，45℃静置10 min。然后挥干衍生液，用10%乙腈水溶液定容至0.5 mL。

4 分析条件

色谱柱：	Diamonsil C18（2），250×4.6 mm，5μm（Cat.#99603）
流速：	1.0 mL/min
检测器：	荧光检测器，Ex:365 nm；Em:435 nm
柱温：	30℃
进样量：	20 μL
流动相：	A：水； B：异丙醇+乙腈=3+2

梯度设置

时间/min	0	5	15	20	21	30
A%	90	80	80	60	90	90
B%	10	20	20	40	10	10

5 添加回收结果

5.1 牛奶中黄曲霉毒素添加回收结果

分析物	添加水平(μg/kg)	回收率/%	RSD(n*=4)/%
黄曲霉毒素B1	1.0	86.09	2.81
黄曲霉毒素B2	1.0	83.94	2.04
黄曲霉毒素G1	1.0	83.28	1.58
黄曲霉毒素G2	1.0	92.15	3.71
黄曲霉毒素M1	1.0	93.82	3.62

5.2 奶粉中黄曲霉毒素添加回收结果

分析物	添加水平(μg/kg)	回收率/%	RSD(n*=4)/%
黄曲霉毒素B1	2.0	95.24	3.69
黄曲霉毒素B2	2.0	75.77	2.65
黄曲霉毒素G1	2.0	78.65	2.43
黄曲霉毒素G2	2.0	85.08	1.79
黄曲霉毒素M1	2.0	86.72	4.21

5.3黄曲霉毒素HPLC图

5.4 牛奶中黄曲霉毒素检测HPLC图

黑色：黄曲霉毒素标准溶液1.0 ng/mL色谱图；

蓝色：牛奶中黄曲霉毒素加标1.0 ug/kg色谱图；

粉色：牛奶未添加黄曲霉毒素色谱图。

5.5 奶粉中黄曲霉毒素检测HPLC图

黑色：黄曲霉毒素标准溶液1.0 ng/mL色谱图；

蓝色：奶粉未添加黄曲霉毒素色谱图。

粉色：奶粉中黄曲霉毒素加标2.0 μg/kg色谱图；

注：ProElut^TMSPE法检测黄曲霉毒素M₁的详细解决方案请链接http://www.dikma.com.cn/Application/show/id/606

黄曲霉毒素检测相关产品信息(现货)：

(参考GB5413.37-2010乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定，GB/T 5009.23-2006 食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定等标准)

货号	名称	规格
样品前处理
65904	黄曲霉毒素检测专用固相萃取柱 ProElut^TM AFT （可用于黄曲霉毒素总量及黄曲霉毒素M1的测定）	1500mg/12mL, 20/pk
82O-COIAC1005	黄曲霉毒素M1免疫亲和柱	3mL, 25/pk
82O-COIAC1001	黄曲霉毒素总量(B1、B2、G1、G2) 免疫亲和柱	1mL, 25/pk
82O-COIAC1004	黄曲霉毒素总量(B1、B2、G1、G2) 免疫亲和柱	3mL, 25/pk
244358	12管防交叉污染真空SPE萃取装置	12位
4803	1,3,6mL柱管通用连接器	15/pk
4806	考克(控制流量)	15/pk
99011	真空/正压两用泵，无油	1/pk
99013	抽滤瓶套装 (包括硅橡胶管2米,2L抽滤瓶及橡胶塞)	1/pk
37177	针头式过滤器 Nylon	13mm,0.22μm 100/pk
37180	针头式过滤器 Nylon	13mm,0.45μm 100/pk
标准品
51-46304-U-1EA	黄曲霉毒素混标（B1,B2,G1,G2）	5 × 1mL in Methanol Aflatoxin B1, 1μg/mL Aflatoxin B2, 0.3μg/mL Aflatoxin G1, 1μg/mL Aflatoxin G2, 0.3μg/mL
51-46319-U-1EA	黄曲霉毒素M1[6795-23-9]	1mL, 10μg/mL in acetonitrile
51-46323-U-1EA	黄曲霉毒素B1[1162-65-8]	1mL 3μg/mL in benzene:acetonitrile (98:2)
51-46324-U-1EA	黄曲霉毒素B2[7220-81-7]	1mL 3μg/mL in benzene:acetonitrile (98:2)
51-46325-U-1EA	黄曲霉毒素G1[1165-39-5]	1mL 3μg/mL in benzene:acetonitrile (98:2)
51-46326-U-1EA	黄曲霉毒素G2[7241-98-7]	1mL 3μg/mL in benzene:acetonitrile (98:2)
色谱柱及保护柱
99603	反相高效液相色谱柱 Diamonsil C18(2)	250 × 4.6mm, 5μm
6201	EasyGuard C18 保护柱	10 × 4.0mm 1/pk 2个柱芯+1个柱套
87003	UPLC专用色谱柱 Endeavorsil C18	1.8μ, 100 × 2.1mm
HPLC溶剂Ÿ缓冲盐Ÿ离子对试剂
50102	甲醇 HPLC级	4L
50101	乙腈 HPLC级	4L
50144	甲酸 HPLC级	50mL
50122	异丙醇 HPLC级	4L
50106	丙酮 HPLC级	4L
50115	正己烷 HPLC级	4L
50134	三氟乙酸 HPLC级	50mL
通用色谱产品
52401B	瓶架/蓝色（现货）	50孔
52401A	瓶架/白色（现货）	50孔
5323	样品瓶（棕色/螺纹）	2mL, 100/pk
5325	样品瓶盖/含垫（已经组装）	100/pk
H80465	HPLC 进样针	25μL

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2012/1/13 11:44:13 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

色谱柱分离黄曲霉毒素B1，B2,G1，G2，M1的效果还不错，可以参考一下。

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微雨燕双飞

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2012/1/16 9:31:23 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 happytiankong1(happytiankong1) 发表:
色谱柱分离黄曲霉毒素B1，B2,G1，G2，M1的效果还不错，可以参考一下。

我们也觉得分离的灰常好

，不禁要为我们的固相萃取柱和钻石柱喝彩！

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2012/3/1 13:18:33 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

基本认识　　
1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为1类致癌物,

黄曲霉毒素

是一种毒性极强的剧毒物质.黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡.在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B1最为多见，其毒性和致癌性也最强.

　　B1是最危险的致癌物，经常在玉米，花生，棉花种子，一些干果中常能检测到。它们在紫外线照射下能产生荧光，根据荧光颜色不同，将其分为B族和G族两大类及其衍生物。AFT目前已发现20余种。AFT主要污染粮油食品、动植物食品等；如花生、玉米，大米、小麦、豆类、坚果类、肉类、乳及乳制品、水产品等均有黄曲霉毒素污染。其中以花生和玉米污染最严重。家庭自制发酵食品也能检出黄曲霉毒素，尤其是高温高湿地区的粮油及制品种检出率更高。

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