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主题：【讨论】提问帖(3.1)：HPLC色谱柱性能的评价？

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微雨燕双飞
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发表于：2012/03/01 21:27:21 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
HPLC色谱法是目前使用非常广泛的一种分析手段，而色谱柱作为色谱分析的心脏又起着至关重要的作用。您是否使用HPLC色谱柱？在您看来，如何才能科学合理的评价一根色谱柱性能的好坏？

恭喜省部重点实验室获得迪马奖励积分

答案：
对于色谱柱的评价，仁者见仁智者见智，下面给出我认为的评价指标

1.柱效：
通常，以指定的一组标准物质为样品，测定它们在柱子上的理论塔板数。以作为柱效的衡量指标，这种标准溶质的选择，因不同的色谱模式而异。也因不同的使用目的而有所不同。一板情况下．要求它们具有不同的保留因子（例如：第一个化合物k=0,其余的在2-10范围内）例如，对于反相填料，可以选择一组具有不同极性的芳香族化合物，这一组标准物质可由苯、萘、菲或苯、甲苯、二甲苯等为基本组分，再添加以苯酚和苯胺等酸、碱性溶质而成。不同的厂家推荐的标准溶质往往相差很大，如有的由屎嘧啶、苯甲酸甲酯、甲苯和萘组成(Dikma)。其目的是观察它们同时分离性质差异很大的化台物的能力，其中的尿嘧啶兼顾了碱性物质，对碱性物质的分离能力是填料残余硅羟基和杂质金属离子含量多少的反映。需要注意的是，新购买来的柱子在实验室中所测得的柱效，往往低于生产厂家给出的柱效，排除在保存和运输中所引起的柱性能的变化等因素外，柱外效应的影响可能是主要的原因。只要将柱外效应减至最小（主要是自进样阀至柱头，以及自柱头至检测器的连接管），一般就可以得到满意的色谱图。

2.色谱峰峰形对称性：
从色谱图上可以测量并计算柱每一个峰的不对称因子As。商品色谱柱的As值，应在0.9-1.2之间。超过此值，说明柱子填充不佳或填料因制造不良而对溶质有较强的非特异性吸附。


3.分析时间：
当我们使用同一规格的色谱柱的时候，在保证分离度的情况下我们还是希望保留时间越少越好（这样可以提高我们的工作效率）。所以我们要求一根色谱柱既要分离性强（柱效高）但同时又保留时间短，但二者又是相矛盾的两个概念（柱效和保留时间是成反比的，提高柱效往往意味着保留时间就延长），所以色谱柱的研发者在填料的设计上必须采用二维的设计理念，既要提高柱效（带来更高的分离性能）又要缩短分析时间，迪马科技的额Diamonsil C18就是这种二维设计理念的产物。



4.选择性和分离度：
当遇到多组分混合样品（特别是包含酸、碱、极性和非极性组分的复杂样品）时，不同的色谱柱对其中的每一个组分的保留能力（出峰时间）存在着差异，即选择性不同。一般来说，在比表面积相同的条件下，色谱柱的碳载量越高，键合相密度越大，对复杂混合样品的选择性和分离度就越强，Diamonsil C18(2) 的碳载量高达27%，能够很好的分离复杂混合样品。


5. pH稳定性：
常规C18 柱在流动相pH 值低于2 或高于7.5 的条件下使用时会发生键合相水解或硅胶溶解的现象，造成柱效和分离度下降，柱子使用寿命大大缩短。然而经过特殊修饰或者采用先进的键和技术往往可以提高色谱柱的pH值稳定范围，例如迪马科技的Diamonsil C18(2)的pH范围就拓展到了1.5-9；极性修饰的Spursil C18系列的pH范围1.5-10，Inspire C18系列 pH 范围1-11。在色谱柱制造领域，拥有一个较宽的pH 适用范围并不罕见，但使用者往往关心的是在较高或者较低的pH 条件下色谱柱能否保持长久的耐受性和稳定性。


6.使用寿命：
色谱柱虽然是消耗品，但是对于使用者而言，一款能够长时间使用的色谱柱不仅减少了频繁更换色谱柱带来的重新进行方法验证、条件摸索等工作，还大大节约了用户的使用成本。迪马科技生产的硅胶填料具有极为光滑的表面和规则的球体外型，最大程度上减少了键合和装填过程中出现颗粒划伤及损伤的几率，先进的填装技术及工艺使柱床更稳定，再配合使用者做好使用和维护工作，从本质上保证了较长的使用寿命。通常以重复进样这种疲劳实验来考察色谱柱的使用寿命。


7.批次重现性：
批次重现性也是色谱柱的一个重要的性能指标，作为使用者都希望自己购买的不同批次的色谱柱能够具有相同的分离性能，从而保证实验结果的的稳定重现，所以作为色谱柱的研发者我们也非常注重色谱柱的批次重现性，这个指标也是我们对于色谱填料性能考察的指标之一。


8.柱压：
对于使用者来说，希望柱子既有高分离效率，又需要具有较低的操作压力。
对一根柱子来说，所需的操作压力是由其渗透性所决定的。柱压还与流动相粘度，固定相颗粒粒径，柱长，填充方法等有关，为最大限度延长柱寿命，操作压力应最小，日常分析时柱压应保持在3000psi以下

P=250LηF/dp2dc2

L----柱长，cm; η—流动相粘度，mPa·s；

F---流速，mL/ min; dp---填料直径，µm；

dc ----柱内径，mm
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2012/3/1 21:43:09 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
分别比较了6种反相(RP)色谱柱评价方法和6种强阴离子交换(SAX)色谱柱评价方法，以方法稳定性、死时间、塔板数、不对称度及分析时间比较了不同评价方法各自的优缺点，对生产者和使用者具有一定的实际意义。 基于比较研究，发展了新的RP色谱柱和SAX色谱柱评价方法。建议评价RP色谱柱以甲醇／20mmol／L磷酸盐缓冲液(90：10，v／v)作流动相，尿嘧啶、甲苯和阿密曲替林作为标准样品，其中尿嘧啶用来标记死时间，甲苯衡量色谱柱分离中性样品的柱效和色谱填料疏水性，阿密曲替林衡量色谱柱分离碱性样品的柱效和不对称度。建议评价SAX色谱柱评价以50mmol／LKH_2PO_4缓冲液作流动相，腺苷、CMP、AMP、UMP和GMP作样品，其中腺苷用来标记SAX色谱柱的死时间，GMP用以衡量色谱柱柱效。
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yu3226033
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2012/3/1 21:53:30 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
选用色谱柱的要考虑被分离的物质在什么类型的柱子上分离效果好。
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yu3226033
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2012/3/1 21:57:39 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
1是你要测量的组分可以分得开。
2是你要测量的组分在柱子里的保留时间要短。（分的开是前提）
3就是柱子的稳定性要好。即，进样量、柱前压、柱温、出现微小变化时，各个组分的保留时间不会发生太大的变化。
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省部重点实验室
gl19860312
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2012/3/1 22:30:23 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
如何才能科学合理的评价一根色谱柱性能的好坏？
就我所知道的有：柱效、分离度、填料的粒经，还有方法稳定性、死时间、塔板数、不对称度及分析时间。
其中柱效，从名字上理解是色谱柱的分离效果。色谱柱的有效塔板数越大或有效的塔板高度越高，色谱柱的柱效越好，类似于每个踏板的分离效率相同，有效塔板数越多，最终得到的物质越纯。

另外，色谱柱的好坏是相对样品来的，样品不一样 柱子的表现可能就不一样了，一般那种通用型的柱子都差不多。

咱们广大的分析检测人员，其实注重的就是使用情况如何。说说自己使用色谱柱的经历悟出来的：
1、峰分的开不开、峰型好不好、对称性如何

2、【分析溶液中有机酸】普通型的色谱柱与专用的色谱柱：
打个比方，迪马科技的普通型柱子【钻石一代 二代】，报价2300左右吧；【思博尔】专用色谱柱4500  【印象中价格好像是去年的 不知道记错了没】
之间的区别主要在哪？ 耐水性质！！专业分离分析！！  专用的色谱柱可耐水较长时间，并且出的峰峰型很好。

3、使用寿命。这个当然是越长越好。在这又要涉及到色谱柱的维护保养了

4、重现性好不好。

5、性价比

6、耐PH范围【范围在一定度量内 决定了色谱柱的使用对象】o

另外，还有一种情况，色谱柱的分析条件可不可根据分析对象的更改适用于更多的流动相。【当然一般都是专门分析某一种或者几种，不可将范围扩大化】
再者，等到由于柱头的色谱填料的塌陷，我们将色谱柱方向倒着一样使用，就更好啦！！！


下面是我搜集的性能标准：

1测量的组分可以分得开。（分的开是前提）

2测量的组分在柱子里的保留时间要短。

3就是柱子的稳定性要好。即，进样量、柱前压、柱温、出现微小变化时，各个组分的保留时间不会发生太大的变化。

看到一份资料，给大家分享一下。    色谱柱分离性能指标的评价

　　常用选择性、分辨率（分离度）、柱效率来表示柱子的分离效能。

其相关概念为：

　　1、分离因子：系指两组分保留值(TR或VR)之比值，常用来表示柱子的选择性。分离因子大，分离较好，这不是绝对的，柱效的好坏也影响分离因子的真假。

　　2、分离度：相邻的两个色谱峰中，小峰峰高和两峰交点的高度之差与小峰峰高之比值，分离度常用来描述未全分离色谱峰的分离程度。一般要求分离度大于0.5.

　　3、分离不纯度：表示一峰物质混入另一峰物质中的百分含量。

　　4、分配系数K：又称平衡常数，是指在一定温度和压力下，气_液相间达到平衡时，组分分配在液相中平均浓度与其分配或溶解在气相中的平均浓度之比值。分配系数只随柱温、柱压变化，与柱中气相、液相体积无关；如果两组分具有相同的K值，则它们的峰是重合的。反之，K值差别越大，则峰分离的越好。

　　5、分配比k：组分在固定相中的量与在流动相中的量之比，k值又称容量因子、容量比、分配容量。分配比是衡量柱子对组分的保留能力的参数。分配比越大，则保留时间越长，分配比为0，则表示组分在固定相中不溶解。

        6、分辨率R：它是指混合物中相邻两组分在色谱柱中的分离情况。相等于相邻两组分色谱保留值之差与此两组分色谱峰峰底宽度总和之半的比值。R=1.0，两组分稍有重迭；R=1.5，两组分基本分离。

　　7、总分离效能指标：指相邻两组分色谱保留值之差与此两组分半峰宽总和之半的比值。

　　8、柱效率：色谱柱在分离过程中由动力学因素所决定的色谱分离效率。

　　9、理论塔板高度：相当于一个理论塔板的高度，其值以柱长与理论塔板数之比来表示。

　　10、有效塔板高度：相当于一个有效理论塔板的高度。

　　11、理论塔板数：用来描述色谱柱效率的一个指标。

　　12、有效塔板数：指由调整保留值与色谱峰宽的比值。

另外一份资料————色谱柱性能指标

一.某指定容量因子的理论塔板数N；
理论塔板数越大，柱效越高
N=16(Tr/W)*2
Tr:谱峰的保留时间
W：峰宽
*2：平方
提高理论塔板数的因素包括：
1.色谱柱填充良好，粒度分布范围越窄，填充色谱柱床的稳定性越好、柱效越高，同时压力降最小，一般要求粒度分布范围不超过平均值的正负50%；
2.增加色谱柱长度，长度一般在100--300mm；
3.采用较小微粒填料，用相对较小的填料，目前常用约5微米粒径固定相，也有1.5~3微米的多孔或无孔微粒；
4.采用低黏度流动相；
5.升高色谱柱温度；
6.采用小分子化合物测定。

二、峰不对称因子As，理想的As为0.95~1.1（绝对的对称峰值为1）；
三、两种不同溶质的选择性；
四、色谱柱的反压，用不同规则的微粒填充，色谱柱柱的压力可能会高；
五、保留之的重新性；
六、键和相的浓度；
七、色谱柱的稳定性。
该帖子作者被版主 diamonsil-girl加 2积分， 2经验，加分理由：迪马奖励积分
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2012/3/1 23:19:42 Last edit by gl19860312
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2012/3/1 22:34:44 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 省部重点实验室(gl19860312) 发表:
占座先
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敬业，掌声鼓励，热切期待ing
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dahua1981
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2012/3/2 8:43:30 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
我认为能满足要求的就是好柱子
可能讲究起来会与很多的道道
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dahua1981
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2012/3/2 8:46:01 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
评定毛细管柱的性能有三项最为重要的指标，即柱效、表面惰性和热稳定性。这三项指标是分别测定的，但是它们也有一定的联系，如活性高时拖尾因子大，同时柱效也会降低。一般评价色谱柱的方法是在一定的色谱条件下分离一组测试混合物，测试混合物中含有各种官能团，以便考核色谱柱的各种性能，这些化合物有烷烃、芳烃、醇、二元醇、醛、酮、酚、胺、酯和游离酸，普遍实用的是所谓 Grob试剂，其组成和浓度见表．
　　　　　　　　　　　　　　　Grob试剂的组成和浓度 组 成 浓度/mg·mL-1  组 成 浓度/mg·mL-1
十二酸甲酯 41.3  壬醛 40
十一酸甲酯 41.8  2.3-丁二醇 53
癸酸甲酯 42.3  2,6-二甲基苯胺 32
癸烷 28.3  2,6-二甲基苯酚 32
十一烷 28.7  二环己胺 31.3
1-辛醇 35.5  2-乙基己酸 38

用Grob试剂测试SE-52毛细管柱的色谱如下图所示：

Diol—2,3-丁二醇； C10—正癸烷； C8-OH—正辛醇； C11—正11烷；C9-OH—正壬醇； DMP—2,6-二甲基苯酚； DMA—2,6-二甲基苯胺

二、评价色谱柱的柱效
1、柱分离能力的测量：每米柱长理论塔板=[5.54×(tR/Wh)2]÷L（注：式中应为（tR/Wh）的平方）
2、涂渍效率，涂渍效率用下式进行计算：
　　CE=(hmin/h)×100% 　式中CE —涂渍效率；hmin—最小理论塔板高度；h —实际测定的理论塔高度。
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dahua1981
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2012/3/2 8:52:59 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
1.柱效
2.热稳定性
3.测试重现性
4.测试稳定性
5.表面惰性
6.柱压能否满足仪器要求
7.峰不对称因子As，理想的As为0.95~1.1（绝对的对称峰值为1）；
8.两种不同溶质的选择性；
9.色谱柱的反压，用不同规则的微粒填充，色谱柱柱的压力可能会高；
10.保留值的重现性；
11.键和相的浓度；
12.色谱柱的稳定性。

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yifan1117
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2012/3/2 8:55:46 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
某指定k值的塔板数N
峰不对称因子（As）
两种不同溶质的选择性（α）
色谱柱的反压
保留值（k）的重现性
键合相浓度（是否合适）
色谱柱的稳定性
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微雨燕双飞
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2012/3/2 9:10:04 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
大家还有高见吗? 关于色谱柱的评价，这肯定是仁者见仁智者见智的事情；
我们要讨论的目的也是综合各方面的意见后得出一个相对大家都共同认同的标准出来
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手机版： 提问帖(3.1)：HPLC色谱柱性能的评价？
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