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主题：【分享】高分辨率激光共焦显微成像技术新进展

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发表于：2012/03/02 16:03:20 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

共焦显微镜因其高分辨率和能三维立体成像的优点被广泛应用在生物、医疗、半导体等方面。文章首先分析了影响共焦显微镜分辨率的因素，主要有光源、探测器孔径和杂散光等；并结合这些因素介绍了双光子共焦碌微镜、彩色共焦显微镜、荧光共焦显微镜、光纤共焦显微镜；然后从提高系统成像速度的方面介绍了波分复用共焦显微镜和频分复用共焦显微镜；最后分析了共焦显微镜的发展趋势。

一、引言

随着人们对于生物医学的研究，传统的光学显微镜已经无法满足研究的需要，人们需要可以实现三维成像的显微镜。1957年Marvin Minsky提出了共焦扫描显微镜的原理。1969年，耶鲁大学的Paul Davidovits和M．David Egger设计了第一台共焦显微镜，1987年第一台商业化共焦显微镜的问世，真正实现了三维立体成像。与普通光学显微镜相比，共焦显微镜具有极其明显的优点：能对物体的不同层面进行逐层扫描，从而获得大量的物体断层图像；可以利用计算机进行图像处理；具有较高的横向分辨率和纵向分辨率；对于透明和半透明物体，可以得到其内部的结构图像；还可以对活体细胞进行观察，获取活细胞内的信息，并对获得的信息进行定量分析。

自共焦显微原理被提出以来，引起了研究者的广泛关注，提高显微系统的分辨率和改善系统的性能是研究者开发新型显微镜时考虑的主要因素。近几十年，国内外学者通过对共焦显微成像系统的三维点扩散函数、光学传递函数等方面的分析，得出影响显微系统分辨率的因素，主要包括系统的激励光源、探测器孔径、杂散光等。此外，共焦显微镜的成像速度也是决定系统性能的一个重要因素，专家们也一直在进行提高系统成像速度的研究。本文主要从提高显微系统分辨率和系统成像速度这两个方面来介绍共焦显微镜的发展情况。

二、共焦扫描显微镜分辨率的提高

光源、探测器孔径和杂散光等是影响共焦显微镜分辨率的几个主要因素，因此可以通过改善这些方面来提高显微系统的分辨率。

1.光源

显微镜的成像性质在很大程度上取决于所采用光源的相干性，有关研究表明，光源相干性好的系统其分辨率要比相干性差的系统要好，并且照明光源对分辨率的改变范围达到了26.4%。因此，选取适合的照明光源对提高显微系统的分辨率有很大帮助。常规的共焦扫描显微镜主要使用普通单色激光作为光源，随着技术的进步，目前已经出现了使用飞秒激光、超白激光、高斯光束作为光源的共焦显微镜，以提高系统性能，获得更高的分辨率。

①飞秒激光为光源的双先子扫描共焦显微镜

双光子扫描共焦显微镜通常使用近红外的飞秒激光作为激发光源，由于红外光具有较强的穿透性，它能探测到生物样品表面下更深层的荧光图像，并且生物组织对红外光吸收少，随着探测深度的增加衰减会变小，另一方面红外光的衍射低，光束的形状保持性好。2005年，Wild等人利用双光子扫描共焦显微技术实时观察和定量分析了PAHs在植物叶片表面和内部的光降解过程。后来又进一步研究了菲从空气到叶片的迁移过程、菲在叶片内部的运动及其分布情况等，该技术可观测PAHs在叶片内部的最大深度约为200μm。

②白激光( supercontinuum laser）为光源的彩色共焦显微镜

彩色共焦显微镜是利用光学系统的彩色像差，光源的不同光谱成分会聚焦到样品的不同深度，通过分析由样品反射的光谱能有效地获得样品的扫描深度。2004年，美国宾夕法尼亚州立大学的Zhiwen Liu课题小组使用光子晶体光纤产生的超连续谱白光作为彩色共焦显微镜的光源，这种超连续谱白光具有大的带宽，能够提高系统的扫描范围，能达到7μm扫描深度。另外超白激光有较高的空间相干性，无斑点噪声，能提高系统的信噪比和扫描速度。

③使用高斯光束的荧光共焦显微镜

荧光共焦显微镜是通过激光照射样品激发样品发出荧光，再通过探测器接受荧光对样品进行观察的共焦显微镜。华南农业大学的杨初平等人研究了不同光源孔径和束斑尺寸的高斯光束对荧光共焦显微镜分辨率的影响表明：与一定孔径尺寸的平行光束相比，采用高斯光束系统可以获得更好的分辨率。

2. 探测器孔径和杂散光

共焦显微镜中探测器孔径能滤除部分杂散光，提高系统的分辨率和信噪比。根据相关文献对共焦扫描显微镜的三维光学传递函数与探测器孔径之间的依赖关系的研究，可以得到探测小孔直径为：d=β*1.22λ/NA，式中，β为物镜的放大率，λ为光的波长，NA为物镜的数值孔径。由该公式确定探测器小孔的直径，一方面满足了共焦扫描系统对探测器小孔直径的要求，从而保证高的横向和纵向分辨率，另一方面，又最大限度地使由试样中发射的荧光能量被探测器接收。为了更进一步提高系统分辨率，许多研究者对共焦显微镜中探测孔径进行了改进，例如使用单模光纤代替普通针孔孔径，还有双D型孔径等。

① 使用单模光纤的光纤共焦显微镜

在光纤共焦显微镜中用光纤分路器代替传统共焦显微镜中的光束分路器，并以单模光纤来代替光源和探测器的微米尺寸针孔孔径。使用单模光纤的优点在于：首先，在采用寻常针孔制作的共焦显微镜中，光源、针孔、探测器等有可能不在一条直线上从而会引起像差；但是在光纤作为针孔的共焦显微镜中，即使有的部件偏离直线时也不会引入像差。其次，使用单模光纤代替微型针孔，容易清除针孔的污染，而且不易受污染。第三，在使用光纤的系统中，可以自由移动显微镜部分而不必挪动探测器。2006年德克萨斯大学使用光纤共焦显微镜进行口腔病变检测，测得的系统横向和轴向分辨率分别为2. 1µm和10µm，成像速度为15帧／s，可观测范围为200µm×200µm。

② 具有D型孔径的共焦显微镜

近几年，具有对称D型光瞳的共焦显微成像技术引起广泛的关注，图1所示是该系统示意图。2006年美国东北大学的Peter J．Dwyer等人使用这种共焦显微镜进行了人体皮肤内部成像的实验，测得横向分辨率为1.7士0.1µm。2009年新加坡国立大学的Wei Gong等人采用傍轴近似方法理论分析了在共焦显微镜中使用双D型孔径对轴向分辨率的影响。分析表明在图1中的d值给定时，进入瞳孔的光信号强度l会随着探测器尺寸的增加而增加；但是在探测器尺寸给定时，光信号强度I会随着d的增加而单调递减。在使用有限大小的探测器时，改变d的大小，轴向分辨率可以得到改善。

图1 双D型孔径共焦成像系统示意图

在共焦成像光学系统中，到达像面的杂散光会在像面上产生附加的强度分布，从而进一步降低了像面的对比度，限制了系统分辨率的提高，因此在显微系统设计时，杂散光的影响也是不容忽视的。一般除了使用探测小孔来抑制杂散光，其他的一些设备例如可变瞳滤波器等对杂散光也有很好的过滤作用。最近以色列魏茨曼科学研究所的O.sipSchwartz and Dan Oron等人提出在系统中使用可变瞳滤波器，这个滤波器能够使多光子荧光共焦显微镜达到分辨率阿贝极限的非线性模拟，从而改善系统的分辨率。

三、共焦扫描显微成像速度的提高

共焦显微镜快速的成像速度为研究者观察生物细胞中快速动态反应提供了良好的条件。在共焦扫描显微成像系统中，传统的方法是通过改善扫描探测技术来提高成像速度。现有的扫描探测技术主要有Nipkow转盘法、狭缝共焦检测法、多光束的微光学器件检测法。这些方法可以改善扫描速度，但是与系统分辨率，视场之间都存在矛盾，因此又诞生了两种提高成像速度的新型显微镜：波分复用共焦显微镜和频分复用共焦显微镜。

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2012/3/2 16:04:03 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

1. 波分复用共焦显微镜

波分复用共焦显微镜主要是通过不同波长的光聚焦在样品中会形成不同的聚焦深度，同时反射光也具有不同的波长，这样来提高显微系统的分辨率和成像速度，从而改善系统的性能。图2是波分复用成像系统示意图：

图2波分复用共焦显微镜系统示意图

在图2中，通过使用一个波长空间编码/解码器，输入的不同波长的超白光聚焦在样品的不同空间位置上，就形成了在样品上的多点聚焦。反射光通过同一个编码/解码器被重新准直，然后经过空间滤波，最后通过检测反射光和空间滤波光的光谱，得到一个样品阵列点的图像。波分复用显微成像技术能够有效地抑制不同点之间的串扰，并且波分复用技术把三维扫描问题降为二维的。该系统可以达到4nm的成像深度的变化，横向扫描范围达到了130µm。2006年美国的Kebin Shi等人提出使用超连续谱的波分复用共焦显微成像系统，通过优化探测孔径，可以得到0.75µm的轴向分辨率和80%的探测效率，能够实现波长范围为500nm到700nm的波段探测，并可以达到每像素3. 25nm的深度灵敏度。

① 光谱编码共焦显微镜

在光谱编码共焦显微镜中也使用了波分复用技术，通过一个透射光栅把不同波长的光指向不同的横向位置，并对从样品反射回来的一维空间信息进行编码。该系统使用输出功率为470µW、中心波长为940nm、带宽为75nm的超辐射发光二极管作为光源，这种共焦显微镜能够提供保证人体组织无运动伪影成像，还可以保持足够小的尺寸以纳入小直径导管或者内窥镜中进行体内生物医学研究。2005年麻省理工学院的C．Boudoux等人在光谱编码共焦显微镜中使用一个快速波长扫描源(a rapidwavelength swept source)进而获得了一个30帧/s的大视场成像，系统的横向和轴向分辨率分别为1.4µm和6µm，对人体皮肤的成像深度可达350µm，并能对细胞和亚细胞进行实时观察。

②使用波分复用技术的双光子荧光显微镜

波分复用技术以前主要应用在反射型共焦显微镜中，这限制了其在生物学中的应用，因此2006年宾夕法尼亚州立大学的K. Shi等人提出把波分复用扫描技术应用于双光子荧光成像系统。通过频分复用技术的应用，双光子荧光显微系统的扫描范围能达到100µm。

2. 频分复用共焦显微镜

频分复用荧光共焦显微镜是把频分复用技术应用到荧光共焦显微镜中，通过对激光光源进行分光调制，然后再对收集到的荧光进行解调来实现对样品的三维观测的。这样可以实现无扫描多点多通道同时探测，降低了观察时间，提高了检测效率，增强了系统的性能。

图3所示是一个频分复用双通道荧光共焦显微镜系统原理图。

首先，激励激光束被分光棱镜BS1分成了两光束，它们经过光斩波器分别被调制到不同的载波频率，记ω₁=πf₁ 和ω₂=πf₂。然后，调制后的两束光再通过分光棱镜BS2后合并在一起，再通过分光棱镜BS3，使两束被调制的光束以微小的角度变化通过物镜，耦合到物镜的后孔径光阑，并在物镜后方的样本上呈现出两个聚焦点（可以通过调整平面镜Ml和M2的反射角来调整两束入射光束的相对角度来改变两点之间的距离）。样品在这两个聚焦点被激发产生荧光，荧光被物镜聚焦后再通过分光棱镜BS3反射到分光棱镜BS4（BS4的作用是为了可以同时观察像面和两亮点的位置所在）。光信号通过BS4后，一部分光束被物镜成像后通过CCD接收传送到计算机上，而另一部分光经过滤波器滤除了干扰光线，只传送荧光。最后，两路荧光通过单模光纤被合并后传送给光电倍增管PMT，通过PMT的光电转换，再经过数据采集，在计算机中进行傅里叶变换处理就得到观测结果。

图3频分复用双通道荧光共焦显微镜工作原理图

目前宾夕法尼亚州立大学的Shizhuo( Stuart)Yin教授课题组已经完成了双通道双频复用的荧光共焦显微镜的生物细胞钙离子浓度实时测量实验。该系统完成了在心肌细胞激励收缩过程中的双荧光点钙离子分布，系统横向和轴向分辨率达到200nm和100nm．时间分辨小于1ms，而且已经实现两点荧光同时跟踪。

在研究中，我们提出使用一种新型的光电材料一聚合物分散液晶( PDLC)制备的聚合物分散液晶全息光栅( H-PDLC)阵列代替光斩波器对激励激光进行调制，因为PDLC具有在电压驱动下透过性会发生改变的电光性能，可以实现对多束激光的实时快速调频，改善了系统性能。用体全息光路制作的聚合物分散液晶材料体全息光栅，空间频率和衍射效率可以做到很高，衍射特性电场可调，且具有开关响应速度快的特点。特别是在多路频分复用显微系统中，H-PDLC电控衍射阵列更能体现出自身的优势，例如设计8路频分复用时，一般需要8个斩波器，而采取HPDLC衍射阵列只需一个2×4的阵列就可以办到。

H-PDLC阵列作为频分复用荧光共焦显微技术中的光斩波器，具有无机械运动部件、速度快、易于集成和小型化等优点；在全息光路中采用逐次掩模曝光的手段制作的H-PDLC电控衍射阵列，能实现对多束激光的实时快怏速调频，克服频分复用荧光显微系统的局限，加速系统性能的改善。

三、结论

近年来，科学家为了提高共焦显微镜的分辨率对显微成像系统进行了光源、探测器孔径等多方面的优化和改善并不断研究提高成像速度的新方法，分辨率和成像速度的提高使共焦显微镜在生物医学、微电子制造、材料科学和精密测量等领域都有了更广泛的应用。随着共焦显微成像技术会与更多新的技术相结合，共焦显微镜的信噪比和成像质量将得到更大改善，为了能更好地进行体内观测，共焦显微镜也有向小型化发展的趋势。另一方面，有时在分辨率的提高和成像速度的改善之间会有矛盾，因此就需要发展能够兼顾两方面的技术，这是以后研究的一个方向。总之，科学技术的发展必定会促进共焦显微成像技术迈向新的高度，必将推动人们对生命科学进行更深入的研究和探索。

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