主题：【原创】提高IVD仪器的分配准确性

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发表于：2012/05/03 16:16:25 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

日益增加的对于微流控芯片技术的使用，需要将样品体积变得更小，同时缩短得出诊断结果所需的时间，并缩小IVD仪器的整体尺寸。

作者：Carl Sims, Joseph Rotter, and Quan Liu

根据各种指标来看，尽管如今常见IVD的血清或试剂样品容量（100μL）并不大，但仪器设计工程师普遍认为这一阈值已经是落伍的标准。同时，研发高精密度的部件（例如可分配低于20nl体积的泵）为系统设计者和方法开发者提供了新的机遇。例如，IDEX Health & Science LLC (Rohnert Park, CA) 最近和一家大型OEM厂家合作，定制开发一种可分配纳升级的流控模块，该系统需要重复分配小于250nl的体积。同时，通过主动地消除流路中的气泡，可以实现巨大的改进（在小体积分配和检测灵敏度上尤为明显）。

系统工程师和临床医生同样认识到了样品或系统流体中难以消除的小气泡会导致很多不利结果，包括样品损失、分配缺失、临床结果失真和仪器可靠性差。然而，气泡只是冰山一角，因为系统流体中溶解的气体同样可以产生具有误导性的结果。虽然气体无法与水混合，但有可能溶解在水中。当液体和气体（或液体和盐）完全结合时，它们会形成一种溶液，普通的过滤方法无法将其分离。同样，溶解的气体不会因重力而从液体中分离，因为液体分子和气体分子中的物理力将它们紧密结合在一起。这就像盐溶液一样，盐和气体分别与水分子相结合，而不是彼此结合。这些液体都需要脱气。

然而，一旦同一液体达到形成盐溶液或气体溶液的限值，就意味着饱和了。此后，将无法强行在液体中溶入盐或气体，而且溶入的气体或盐与液体的结合会弱于其本身的结合力，因而形成气泡或盐结晶。当这些气泡或盐结晶变得足够大后，这些自我结合的气体分子可以从溶液中分离。在这种情况下脱气技术极为有效。

在仪器的环境内，随着温度条件的变化，气体的溶解度也会发生变化。以水为例，随着温度下降，更多大气（氧气和氮气）会溶解到水中。

溶解的空气与溶剂形成的溶液是均匀的，多余的空气将会形成不均匀的溶液或气泡。但是为什么气泡进入水中后会聚集到表面呢？表面越疏水，气泡和表面的附着力越大。表面越亲水，气泡附着的可能性越小。空气和水的差别很大，因此会附着到其它表面上。输送水的管道一般极为疏水，因此气泡会紧密地附着在其表面上。有时，要去掉气泡，管道中水的流速需要极快。

汽蚀现象
在18世纪初期，工程师们就知道了水中溶解的空气量对很多机械系统有不良作用。深海潜水员和在加压舱里工作的筑桥工人都会发生氮气麻醉或所谓的潜水突升失血病，这种疾病发现，工人或潜水员的血管内会出现气泡。随着工程技术的进步，了解因气泡产生或消灭在金属物体表面产生的汽蚀现象对治理金属表面的损害越发重要。

汽蚀现象是指由于机械应力在流动的液体中产生局部真空，当液体内的压力迅速变化，导致液体压力低于蒸发压时会出现这种现象。此时，液体中溶解的气体会形成气泡。当含气泡的液体处于高压状态下，气泡会破裂，导致液体中出现很小的喷射气流，猛烈地冲击金属表面。潜水艇推进器需要经过精细加工，来避免推进器受力面的气泡形成和破裂。除了加压喷射流造成的金属损伤作用外，气泡破裂的声音也会暴露潜水艇的位置。

在开发用于实验室分析的部件时，高效液相色谱法（HPLC）中要求的急剧增压使得防止系统溶剂中产生汽蚀现象尤为关键，因为这种现象可能造成HPLC泵、单向阀、柱塞杆、管道和接头出现损伤。在19世纪70年代末期，工程师开始设计一种系统，这种系统可以在将溶剂导入HPLC泵之前，在低压下混合两种或两种以上的溶剂。Tokunaga进行的该项种子工程研究对醇、水及二者混合物中的空气浓度进行了研究，清晰地表明需要将空气从将要混合的溶剂中去除以消除气泡（见图1）。
简而言之，醇中空气的容量将近水中容量的7倍，但水与醇的混合物却不能容纳其各自带入的空气含量的总和。Tokunaga发现，在常压下，水-甲醇混合液中只能容纳其各自带到混合液中的空气总含量的38%（介于30%至70%甲醇之间）。关于其它溶剂相互机械作用的研究也表明，沿混合曲线溶解度也发生类似的降低。

如今，众所周知的是HPLC系统会受到移动相中溶解气体的影响。在1978年，一篇论文报道了溶解性气体对低压比例HPLC泵送系统的影响， Steve Bakalyar博士奠定了HPLC脱气的早期标准：在液体中输入氦气来去除溶解的气体，稍后被称为氦气吹扫²。虽然如今的实验室中仍使用氦气吹扫的方法，但是获取和管理罐装加压氦气一直具有难度，需要创新措施。因此，设计出另一种可选择的方案，使液体流经一种惰性的半透膜，通过抽真空去除其中溶解性气体。在被检测的多种惰性含氟聚合物膜中，发现特氟龙的一种衍生物最适合去除溶解性气体，并可满足生产商缩小仪器尺寸的要求。

IVD中的脱气

尽管脱气已被广泛应用于HPLC仪器中，但对使用纯水或水溶液的IVD系统而言，起初认为脱气是不必要的。早期的生物分析员使用空气整段间隔液流通过内直径相对较大的管道-这种方法被称为间歇式流动分析³。这种方法将气泡导入液流中，用以分隔在气泡前后注入的样品，在随后的流程中通过多种被动机制或单纯地忽略气泡相关的检测信号来处置气泡⁴。然而，随着连续流动分析仪的面世，不再使用气泡间隔液流，气泡仍然会对流动系统造成干扰，这些难题从未遇到过。液体样品中的气泡可直接影响分配精密度，因为流控管道中可压缩的空气会改变进样和分配的实际液体体积（见图2和图3）⁵。

纵览化学、免疫分析、血液学和其他分析仪器中用于气泡检测的多种传感器技术，就可以说明这个问题的意义。光学传感器、超声传感器、视频传感器和热传感器都可用于检测流体中的气泡。

如之前所述，空气的疏水性导致气泡几乎会附着在分液系统的每个部位上，需要用速度极高的流体或生成湍流才能冲走流体中的气泡，并将气泡排放出去。这一过程难以操作，而且耗时长、难预测，降低了仪器的通量，也可能要求流路系统的设计兼顾气泡的可视监控。

但是，在诊断仪器相对封闭的环境中，进入仪器的液体通常处于完全平衡的状态，因此，在设计阶段，对水或其他液体进行脱气并不是必须的。然而在日常操作中，由于仪器内外环境平衡条件的变化，设备中液体的脱气能够确保正常的操作，使得患者样本的检验失误率降至最低，而精密度和准确性达到最佳值。对流体的脱气的确会增加系统的成本，但在IVD领域中，一次取样或分液失误造成的损失（可能会对生命造成很大的影响）可能远大于添加脱气环节的成本。

系统工程师面对的难题可能是如何可靠地判断流路中产生气泡的原因，因为机械条件（如汽蚀现象）只是气泡来源之一。尽管仪器工程师尽最大努力消除了溶解的空气，但有时还是会形成气泡。不幸的是，在仪器设计好并投入使用后很久才会出现气泡。

案例分析
有一家公司的现有系统遇到了气泡的难题，这种情况是在正常的仪器停工期（如周末）之后出现的。当系统再次启动时，微气泡在系统的管路深处出现。这一气泡问题比较严重，能造成3%的失误率，这足以造成分析停顿。解决方案使用了专利同轴除泡器，这种产品可使系统流体沿着膜外侧流动，同时在内部制造真空，在不添加额外的系统体积的情况下点对点的进行脱气⁶。在使用了除泡和脱气技术后，气泡问题造成的失误率最终降至了零。

还有台仪器出现了另一种气泡问题，主要是由仪器设计本身造成的。正如现在很多仪器，制造商们从放置在底板上的盒子中批量抽取试剂，送入到仪器中。这种自下向上的抽取过程会引起管线的压降，随着试剂进入仪器机柜，环境温度的明显差异（由泵和其他元件引发的升温）会导致压力进一步下降。最后IDEX与客户合作找出了气泡形成的原因，制造商通过编写一个软件通讯协议，在将液体引入系统的过程中增加一个温度平衡的步骤，从而消除了气泡问题。

即使最为精密的设计也可能出现莫名其妙的失误。一家公司的管道中出现了气泡聚积的现象，这条管道连接了盐水参照溶液和血液分析仪的传感器头。管道有1米长，是由PTFE含氟聚合物制成的。其他液体也经同样长度的管道接至传感器头。仪器的早期研发过程说明了除非所有的液体都经过脱气，否则随着液体从贮液罐流向感应头，管道中都会形成气泡。为确保对流体进行适当的脱气，设计工程师开发出一种多层袋，它的空气渗透率接近零。

使用这种袋子，仪器生厂商可对所有液体进行彻底的脱气，然后供应给最终用户。尽管这种方法成本昂贵，但能够消除几乎所有管路中的气泡(除盐水参照溶液管路之外）。对盐水溶液中溶解空气的定时测定说明了一米长的输液管道可在一夜间实现饱和，但是管道中气泡的形成仍令人费解。如果把管道材质从PTFE换成低渗透的含氟聚合物（FEP），气泡问题的改观仍然有限。
由于在每次进样前按照标准流程都将参照比对盐水的传导率，而由气泡引起的传导率偏差会导致软件认定测试失效（见图4）。软件为此设定了循环冲洗步骤，有利于去除传导电桥被参照侧的气泡，这会帮助改善结果，但不会完全消除气泡。参照标准中的气泡会导致试验失效，对仪器用户而言成本十分昂贵，因为不仅因为试验无法通过，而且还需要再次获取患者样品。

在审核所有的数据后，IDEXHealth & Science的工程师制造了一种在线脱气器（TLD），即克服了流路本身的限制又保留了原来连接已脱气试剂和传感器感应头的管路形式。装在仪器内部的真空源提供了Poridex管腔内的真空，这样在输送的过程中能主动地对从袋子到传感头之间的管线进行脱气。对于安装，在线脱气器的以下三个特征极为关键：在线脱气器可弯曲，在安装好的仪器中很容易装配；在仪器重新启动的几分钟内即可完成整个流路的脱气；在仪器中在线脱气器占空间小。引入在线脱气器后进行的检测说明了其对于盐水参照溶液和患者样本应用的有效性（见图5）。

由于分析仪已经获得FDA的认证，只需对其进行改进，增加对盐桥输送管道的主动脱气，然后重新认证。尽管可以对所有试剂进行脱气，以取代每种试剂的脱气和包装过程中产生的持续成本投入，但需要重复认证可能是此节约成本之举的一个顾虑。因为其它溶液在各自的输送管道中只需停留2至3小时，而盐桥溶液可能需要24小时，甚至更多。由于空气是疏水的，在管道内盐溶液中形成的任何气泡可能附着在含氟聚合物管道的内壁，成为下一个气泡的核心因而增大气泡尺寸。冲洗管道内表面只能去除大尺寸的气泡，而在线脱气器内的Poridex管道是多孔的表面，即使最小气泡也能通过其接触面逃入真空。

膜技术如何工作
IVD流道的不同区域都能从除泡和脱气中获益。在需要精密处理液体的区域例如分配，除泡技术通过从流路中捕获和抽出气泡，通常能解决分配或检测中的不准确现象。（图6）

此外，对于提高批量液体处理的性能，主动脱气是更经济的解决方案，特别当液体是去离子水时，而且需供应系统的多个部位。（见图7）。在线脱气技术可在长距离输送液体时去除气体和气泡，而不需添加系统容积，并且其性能也弥补了介于静止或流动状态之间流体的脱气需求。

结论
随着IVD向小体积分配的方向不断发展，每次分配的准确性变得更加关键。液体中的气泡和气体将在样品或分配体积中所占的比例逐步增加，因此预防性地消除气泡或去除溶解气体以获得分析精确度和准确度显得更加必要。

参考文献
1. J Tokunaga, Journal of Chemical and Engineering Data 20, no.1 (1975).
2. SR Bakalyar, et al., Journal of Chromatography 158 (1978): 277-293.
3. LT Skeggs, Analytical Chemistry 38, no.6 (1966): 31A.
4. L Rosenfeld, Clinical Chemistry 46 (2000): 1705-1714.
5. Q Liu, et al., “The Effect of Degassing on Dispense Performance,” AACC Annual Meeting, 2007.
6. U.S. Patent no.7,144,443.

Carl Sims是IDEX Health & Science（Roseville, MN）的资深Systec 研发科学家。他的联系方式为csims@idexcorp.com。