主题：【已应助】请教 有关物质分析 方法验证专属性和破坏试验

1、酸碱的浓度时间变化对主成分的峰面积下降不成任何规律是以峰面积得出的还是含量检测计算得出的，此种情况建议以含量测定来判定，破坏程度达到10%以上即可。
2、如果酸、碱对后面的检测过程有影响需要中和，如果没有影响可以不用中和直接按标准方法检测。
3、有关物质中包括已知杂质和未知杂质。已知杂质对主成分的相对响应
因子在0.9-1.1范围内时，可以用主成分的自身对照法计算含量，超出0.9-1.1
范围时，宜用杂质对照品法计算含量，也可用加校正因子的主成分自身对
照法。理想的定量方法为已知杂质对照品法与未知杂质不加校正因子的主
成分自身对照法两者的结合。研究人员可根据实际情况选用合适的定量方
法。
4、用于什么项目就用检测什么项目的方法，通常指的是含量测定的专属性，如果杂质是无法定量或半定量检测的，专属性也就没有什么意义了。

个人意见：
1 以API含量计算降低5-10%即可。
2 推荐中和，考虑对系统和柱子的影响。
3 首先未知杂质要有限度，其次分离度要符合要求（这里不明确编辑一下，应该指主峰或已知杂质与未知杂质的分离度，未知杂质与未知杂质不一定要完全分离）。分离度不符合要求，则杂质结果不确定。（同样指主峰或已知杂质与未知杂质的分离度要符合要求，不然已知杂质或未知杂质的结果不能反映真实情况）
4 验证哪个方法就用哪个方法配制。

楼上都回答很详细了，在此谈谈我自己的理解，欢迎各位批评指正

专属性
专属性试验可参考含量测定的专属性验证，不过，有关物质检查的专属性侧重于杂质，即考察溶剂、辅料、添加剂（如防腐剂、助溶剂等）、合成原料、中间体等不干扰待测成分（主峰、杂质）的测定，主成分峰或需定量的杂质峰应与其它峰完全分离。
可接受的标准为：空白对照应无干扰，该杂质峰与其它峰应能完全分离，分离度不得小于2.0。
为验证杂质分析方法的专属性，对于原料药，可根据其合成工艺，采用各步反应的中间体（尤其是后几步反应的中间体）、立体异构体、粗品、重结晶母液等作为测试品进行系统适用性研究，考察产品中各杂质峰及主成分峰相互间的分离度是否符合要求，从而验证方法对工艺杂质的分离能力。
为了考察方法能否有效检测出原料药或制剂中的降解产物，还可根据药物的化学结构特点、制剂的处方与工艺、储存条件等选用合适的酸、碱、光、热、氧化反应等加速破坏性试验来验证分析方法的专属性，必要时可采用二极管阵列检测器、质谱检测器等检测峰的纯度。因为在强制降解试验条件下产生的降解产物较药品货架期产生的降解产物复杂、未知杂质多，分离难度大，上述分析方法可有效地显示各色谱峰的纯度，以免因分离度不符合要求，导致分析结果的不准确。如不具备检测峰纯度的试验条件，可通过适当调整流动相的组成或比例使各色谱峰的相对保留时间发生改变，用同一份经加速破坏试验的供试品溶液进样，然后比较流动相调整前后杂质峰的个数；也可采用TLC法比较同一份经加速破坏试验的供试品溶液在不同展开系统下的斑点个数及位置，以此佐证杂质分析方法的专属性。
强制降解试验对于未知杂质的分离度考察是非常必要的，其目的主要是提供关于杂质（特别是降解物）与主成分的分离情况、样品稳定性及降解途径等重要信息。在试验过程中，应注意破坏性试验要适度，应着重考察敏感条件。如产品在一定条件下稳定，则无必要再提高条件的剧烈程度进行重复试验。破坏试验的程度暂无统一要求，一般以强力破坏后主成分的含量仍占绝大部分为宜。此时已产生了一定量的降解产物，与样品长期放置的降解情况相似，考察此情况下的分离度更具有实际意义。要达到这种破坏程度，需要在研究过程中进行摸索，先通过初步试验了解样品对光、热、湿、酸、碱、氧化条件的基本稳定情况，然后进一步调整破坏性试验条件（如光照强度、酸碱浓度、破坏的时间、温度等），以得到能充分反映降解产物与主成分分离的结果和图谱。另外，通过比较试验前后主峰面积的变化，还可粗略估算降解物对主成分的相对响应因子，了解样品在各种条件下的稳定性，为包装及贮藏条件的选择等提供信息。对于性质相对稳定的药品，如有充分的文献依据或试验数据，则可以免做强制降解试验。
破坏性试验一般采用以下方法做：
①酸降解：一般采用0.1mol/L－1mol/L盐酸或硫酸。
②碱降解：采用0.1mol/L－1mol/L的氢氧化钠溶液。
③氧化降解：采用合适的过氧化氢溶液，必要时可以加热或提高浓度。
④高温试验：通常温度高于加速试验温度的10℃，如50℃、60℃等，对于原料药有时需考虑水溶液或混悬液的降解，考虑在不同的pH值条件下的降解。
⑤光照试验：可采用4500LX。
破坏试验中物料平衡的问题
有关物质检查中，判断一个方法是否可行，不仅要对分析方法进行充分的验证，有时还需考虑破坏试验的物料平衡。可理解为破坏前后药品的质量是不变的，或破坏前后主成分的降解量应与降解产物的增加量相等，以证明有关物质的检测方法能把可能产生的降解产物、杂质都检测出来。比如：氟哌利多注射液，光照10天，UV法测含量下降了10%，采用TLC法未检出杂质斑点；而参照USP标准采用的HPLC法检查时，注射剂中杂质含量高达7.6%。说明TLC法只能检测到部分降解产物，还有大部分降解产物未检测到。物料平衡的计算通常采用以下几种方法：回收量一般要求达到90%。
1、扣除溶剂，比较破坏前后的总峰面积，按：（破坏后的主峰+所有杂质）/（破坏前的主峰+所有杂质）*100%计算回收量。
2、按：破坏后杂质增加量/破坏后主药降解量*100%计算回收量。
3、降解后的样品测定有关物质后，将此样品溶液稀释至主成分含量浓度，测定主成分含量，然后按：（降解后杂质量+降解后主成分量）/（降解前杂质量+降解前主成分量）*100%计算回收量。

原文由 joechim(joechim) 发表:
个人意见：
1 以API含量计算降低5-10%即可。
2 推荐中和，考虑对系统和柱子的影响。
3 首先未知杂质要有限度，其次分离度要符合要求。分离度不符合要求，则杂质结果不确定。

4 验证哪个方法就用哪个方法配制。

同意以上说法，实在可行

感谢楼上各位的建议，目前试了很多不同浓度用量时间的条件，发现当天重复确认降解率是OK的，结果第二天打算正式做了同样条件降解率就不对了，要么高要么底。不知道是否辅料影响，样品是现配现用的，酸和碱这样的破坏试剂也不会有什么不同变化啊？摸索的很头疼的，

目前酸和碱已经用0.01mol/l的在做，还是重现性差的问题，比如昨天摸好了合适的酸碱的用量时间(加0.1-0.5ml酸或碱  室温破坏5分钟进样峰面积计达到降解要求，当天重复都是好的，第二天再同条件就降解率不同了，或低或高。 
依各位大牛的经验分析可能有些什么原因呢？

计算降解率的方法不对？辅料影响？我的样品本身很不稳定？我的破坏条件不够还是破坏后的样品也不稳定？
个人觉得第一个原因，今天去重新按含量计算一下

降解率差别有多大，破坏时光，温度，湿度等条件一致吗，如果始终无法重复，我怀疑是不是检测方法的问题。

原文由 mjxyz(mjxyz) 发表:
目前酸和碱已经用0.01mol/l的在做，还是重现性差的问题，比如昨天摸好了合适的酸碱的用量时间(加0.1-0.5ml酸或碱  室温破坏5分钟进样峰面积计达到降解要求，当天重复都是好的，第二天再同条件就降解率不同了，或低或高。 
依各位大牛的经验分析可能有些什么原因呢？

计算降解率的方法不对？辅料影响？我的样品本身很不稳定？我的破坏条件不够还是破坏后的样品也不稳定？
个人觉得第一个原因，今天去重新按含量计算一下

样品不稳定时很容易出现这种情况，比如室温稍有变化都会影响破坏结果。

回复8楼，样品是不稳定的的，原料本身是个醋酸酯，加上辅料里面有些聚合物的表面活性剂。
提供了一点方向，多谢。接下来打算用恒温来控制降解试试

原文由 有水有渝(xky0230699) 发表:
降解率差别有多大，破坏时光，温度，湿度等条件一致吗，如果始终无法重复，我怀疑是不是检测方法的问题。

同条件降解率前后会差10%-20%，破坏那几天温度差异应该在5度以内吧，方法是药典的老方法，只是因为灭菌工艺变更，有关物质的方法验证要再做一下，