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主题：【求助】每配一次样品和对照品溶液，峰就小一次，至消失

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zidingxianghua
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发表于：2013/08/04 20:23:22 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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做一个甾体皂苷的含量测定，已经做第4次了，问题始终没解决，遂请教。

具体要求如下：

色谱条件要求：

C8的柱子；流动相是乙腈-水（30:70）；检测波长210nm。

样品处理：

取一定量，加75%乙醇超声10分钟，放冷，补足减失重量，滤过，即可。

      对照品也是用75%乙醇溶解。

测试经过如下：

有同一厂家同一品种不同批号两批样品，用C8的柱子做，计算了下，含量合格，但峰实在太难看。怕峰形太差影响结果的准确性，但只有一根这C8的柱子，只好换根C18的柱子，调整流动相试试；峰形很好，进了一针其中一批的样品，计算了也合格，就编个序列继续做下去了。

第四天才发现另一批不合格，只好第五天返工。

第二次，问题出现了。

返工时，同样的仪器，色谱柱，色谱条件，用原来配的对照品溶液，重新处理样品，不合格的那一批还是不合格，结果比上次测的还低一点，合格的那批也不合格了。

又另配了对照品溶液，与之前配的浓度相差不大，但峰面积小多了。但是之前配的对照品峰面积反而变大了，估计是因为流动相微调，把之前没分开的小峰分开了，不至于斜着积分的原因吧。

怀疑过对照品峰面积小，是不是冷冻（对照品要求冷冻保存哈）后没放至室温，直接称，导致称不准。

样品怀疑过的原因  A:是不是不合格那一批取样量大了，浓度高了，导致过饱和，未全溶  B：样品是不是未混匀，取样代表性不够  C：超声时间，功率是不是有问题，是不是超声发热导致样品降解（对照品要冷冻保存嘛）E：是不是第二次配的溶样溶剂有问题

第三次做，更蹊跷了。

之前怀疑的样品的原因都排除了。减少，增加取样量；混匀样品；超声不同时间，用不同超声设备（不同功率）；超声中换水，防止温度升高，水浴上回流处理样品；重配75%乙醇几次，用无水乙醇配也试了，还换用甲醇，样品溶液居然都没有目标峰。但之前两次配的对照品溶液峰高变化不大，高的还是高，低的还是低。

第四次，就是今天。又重配了对照品溶液，换甲醇（色谱纯）溶解，居然对照品也没峰了，用75%乙醇溶解也是。之前配的对照品峰高还是老样子。将第一次配的对照品溶液跟这次提取的测不到目标峰的样品溶液混合，也能出目标峰。

这根柱子换走另一个对照品测试，峰好得很。再换另一根柱，走样品和对照品，还是老样子，之前能出的还出，出不了的还是还是出不了。

总结：一共配了三次对照品，浓度差异不大，但峰面积在变小，第三次就没了。

样品也是，第一次合格的，第二次提取也不合格了，以后干脆目标峰也不出了。

      分析：应该不是目标物不稳定的原因，因为第一次配的对照品，隔了一周，峰高依然变化不大，更何况新配的对照品溶液。

      几次都是我操作，对照品溶液都超声助溶过，应该也是溶了的。而且用紫外扫过，稀释后吸收值会降低，虽然最大吸收波长在约205nm。其实用甲醇比用75%乙醇溶解要好些，几乎振摇就能溶，用75%乙醇必须稍超声一下。

      色谱柱应该也没问题，因为第一、二次配的对照品能出峰，而且稳定，进几针试了，保留时间和峰面积的RSD值都在允许范围。虽然第二次比第一次小得多。而且换了柱子也是一样的情况。

        现在不说提取方法有没有问题，连对照品都不出峰了啊。

      到底是啥原因呢？从来没有遇到过啊。恳请各位亲帮助指点啊，实在是没办法了，该想的都想到了，还是不行。

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2013/8/5 8:56:24 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
我觉得是不是对照品已经变坏了，因为你第一面积最大，第二次面积减小了，第三次直接就没峰了。
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zidingxianghua
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2013/8/5 9:10:54 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 zhoujin83(zhoujin83) 发表:
我觉得是不是对照品已经变坏了，因为你第一面积最大，第二次面积减小了，第三次直接就没峰了。


谢谢回复哈。这个应该不是，如果变坏了，那为什么第一次配的对照品溶液到第四次进样还是稳定呢。而且新配的样品溶液也不出峰了喃，不可能这么不稳定。对照品比较贵，都只有一支，连配了三次液，剩得也不多了，后头换溶样溶剂尝试，都只能称一点点直接到样品瓶，用移液器吸液溶解。
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zidingxianghua
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2013/8/5 9:20:59 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
我能考虑到的都考虑到了，实在没办法了。
麻烦看到的亲帮我判断一下，看哪里还有什么问题，或是帮我问问周围的同行，看有没有遇到过这种问题，是怎么解决的。
现在以有限的经验，只能怀疑是不是硬件出问题，想换台机子，但别人在用。而且觉得硬件出问题的可能性真心不大。
搞得很沮丧，唉。
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doczheng
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2013/8/5 9:44:16 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
鉴于对照品比较贵重，楼主可以用标定过的原料来进行检测，
还有你说的对照品同一支，取超过一次以上，含量多少会有变化的，如果是含有结晶水的晶体颗粒就还好，如果是粉末状的对照品，就算价格再贵，含量的确会有变化的，
处理方法上面楼主做过加标的回收吗？不知道结果如何
还有灯的能量是否正常，能完全排除仪器问题吗
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zidingxianghua
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2013/8/5 11:31:35 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 doczheng(doczheng) 发表:
鉴于对照品比较贵重，楼主可以用标定过的原料来进行检测，
还有你说的对照品同一支，取超过一次以上，含量多少会有变化的，如果是含有结晶水的晶体颗粒就还好，如果是粉末状的对照品，就算价格再贵，含量的确会有变化的，
处理方法上面楼主做过加标的回收吗？不知道结果如何
还有灯的能量是否正常，能完全排除仪器问题吗


这只是算一个检品，我们没有原料，没办法做。呃，我想起来了，还有皂苷总提取物对照，可以配点试一试。

对照品冷冻保存，多次取，特别是皂苷，易吸潮，称量可能也会有误差，这个我也理解，但不至于浓度差异不大，第二次配的峰面积跟第一次配的就差数量级，第三次配的根本就没峰了。

加标回收虽然没做，但取制备的没出峰的样品溶液，加点第一次配的出峰正常的对照品溶液，能出峰的。

仪器硬件问题没排除，准备换台机子试试，但感觉可能性真的不大。

其实以前最怀疑的是溶样溶剂，但自从出峰小，合格的都测不合格了，就另配溶样溶剂，至少配了不下四次，连用无水乙醇配，甚至换甲醇都试过了，还是没峰。不出峰的对照品溶液也上紫外扫描了，在205nm出吸收峰很强的。

这个原因也排除了，就彻底找不到原因了。
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doczheng
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2013/8/5 11:58:25 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 zidingxianghua(zidingxianghua) 发表:
原文由 doczheng(doczheng) 发表:
鉴于对照品比较贵重，楼主可以用标定过的原料来进行检测，
还有你说的对照品同一支，取超过一次以上，含量多少会有变化的，如果是含有结晶水的晶体颗粒就还好，如果是粉末状的对照品，就算价格再贵，含量的确会有变化的，
处理方法上面楼主做过加标的回收吗？不知道结果如何
还有灯的能量是否正常，能完全排除仪器问题吗


这只是算一个检品，我们没有原料，没办法做。呃，我想起来了，还有皂苷总提取物对照，可以配点试一试。

对照品冷冻保存，多次取，特别是皂苷，易吸潮，称量可能也会有误差，这个我也理解，但不至于浓度差异不大，第二次配的峰面积跟第一次配的就差数量级，第三次配的根本就没峰了。

加标回收虽然没做，但取制备的没出峰的样品溶液，加点第一次配的出峰正常的对照品溶液，能出峰的。

仪器硬件问题没排除，准备换台机子试试，但感觉可能性真的不大。

其实以前最怀疑的是溶样溶剂，但自从出峰小，合格的都测不合格了，就另配溶样溶剂，至少配了不下四次，连用无水乙醇配，甚至换甲醇都试过了，还是没峰。不出峰的对照品溶液也上紫外扫描了，在205nm出吸收峰很强的。

这个原因也排除了，就彻底找不到原因了。


之前用C8后面用C18，更换方法没有做过方法验证吗？而且就算同一个样品，不同日期进样，相差是必须的
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hujiangtao
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2013/8/5 13:07:52 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
衰减不能这么快吧
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zidingxianghua
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2013/8/5 13:15:29 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
我说的出的问题，都是用同一根C18柱出的问题，现在换了柱也是一样的。现在都不是配的同一对照品溶液前后几天进样出现响应值差异的问题，这都没有问题。是前后几天配的对照品和样品溶液，浓度很接近，但峰面积越来越小，最后就没峰了哦。说对照品不稳定吧，为什么之前配的对照品溶液正常出峰，之后配的新的反而没峰了喃？说溶剂有问题吧，前后连换试剂，新配了不下5次试过了，还是不出峰。
虽然我的表述可能不清楚，但麻烦各位还是看清楚了再回复，免得耽搁您的时间。
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zidingxianghua
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2013/8/5 13:29:06 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
应该不是衰减太快引起的，那他这个质量标准就有问题了。第一次配的对照品溶
液在之后几天几次进样都稳定，由此可见。只是之后几次新配的对照品和样品溶液反而峰在一次次变小，干脆没了，但浓度差异不大。再强调一遍。
被这个问题搞得如鲠在喉，却无可奈何。算了，解决不了就忙其他事了，等几天再说。不能不解决这个问题，就不做其他事吧，唉。

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