主题：【第七届原创】pH值对液相色谱检测的影响

pH值对液相色谱检测的影响

    做过色谱的同志们都知道流动相是色谱洗脱、分离的重要因素之一（另一重要因素是色谱柱）。在这我们就说说反相液相色谱流动相一些事吧。反相液相色谱流动相中的有机相成分是流动相中的起主要洗脱作用的成分，一般流动相洗脱能力的强弱是和流动相中有机相比例高低有着直接的关系。然而在有些分析过程中，流动相的PH值却对洗脱能力起着非常巨大的作用，换句话说，流动相的PH值如果与要求偏差的较多，流动相的洗脱能力会弱或几乎没有洗脱能力。下面我们就以几个实例介绍下。

    首先我们重点说说高效液相色谱检测荷叶中荷叶碱含量的情况。

    荷叶碱是荷叶中的一种重要成分，是一种阿朴啡型生物碱。把荷叶晒干粉碎，采用纤维素酶预处理、稀盐酸浸泡提取、超声波振动仪超声提取、氯仿萃取等一系列方法提取而成。

    荷叶碱具有降血脂作用，抗自由基、抑制高胆固醇血症和动脉硬化等药疗、食疗功效，具有抗有丝分裂作用，有很强的抑菌功效等。

    分子式：C19H21NO2

    分子量：295.376

    结构式：

色谱条件（药典中的）：

检测器：紫外检测器

色谱柱：Pgrandsil STC C18 250*4.6mm，5um

检测波长：270nm

流动相：乙腈：水：三乙胺：冰醋酸=27∶70.6∶1.6∶0.78（V:V），为了下面介绍方便，我们在这就先把乙腈叫做流动相有机相，其余部分叫做流动相水相，水相水-三乙胺-冰醋酸（70.6∶1.6∶0.78）的PH值大约5.75

流速：1.0ml/min

进样量：20ul

柱温：25℃

对照品色谱图：

供试品色谱图：

  以上色谱图效果较好，一般操作员应该都会很满意吧。

    如果流动相水相中冰醋酸加的较少，pH值约6.1时，对照品色谱图：

    这个色谱图峰形较差，拖尾较严重，有些操作员可能不会太满意。

    如果流动相水相中没加冰醋酸时，对照品色谱图：

    这个色谱图荷叶碱干脆没出峰，这个所有的操作员应该都不会满意。

    这就充分说明高效液相色谱检测荷叶中荷叶碱含量时，流动相PH值对分析结果影响较严重，PH值与要求的相差较大时色谱峰形不好，对结果影响较大，严重时目标物甚至不出峰，所以配制流动相时一定得多加注意。

    另外，如果柱温控制在40℃时，荷叶碱的保留时间可提前至15.5min左右，当然流动相中乙腈含量若能适当增加，荷叶碱的保留时间也会有所缩短，但得权衡供试品中荷叶碱与其它物质的分离度。流动相中乙腈在某些时候也可换成甲醇，同样有不错的分析效果。

    下面我们介绍下饲料中维生素B1（同样适合维生素B2、B6）高效液相色谱检测情况。

色谱条件（参考国标GB/T14700—2002）：

检测器：紫外（UV）检测器

色谱柱：Pgrandsil STC C18 250*4.6mm，5um

流动相：有机相：水相=14:86（V:V），其中有机相是甲醇，水相是50mgEDTA,1.1g庚烷磺酸钠，25ml冰醋酸，5ml三乙胺的1000ml水溶液，另外用冰醋酸、三乙胺调节该溶液pH值至3.4±0.02

流速：1.0ml/min

柱温：27℃

进样量：10ul

波长：246nm

标准品色谱图：

某饲料样品色谱图：

流动相PH值为3.8时，标准品色谱图:

    调整流动相PH值后，结果几乎无变化，说明这个样品检测时受流动相PH值影响较小。

    最后我们再介绍下红曲中桔青霉素高效液相色谱检测情况。

色谱条件（参考国标GB/T5009.222-2008）

检测器：荧光检测器

色谱柱：ASB-C18 150*4.6mm，5um

流动相：乙腈：水（磷酸调pH值至2.5）=65:35（V:V）

流速：1.0ml/min

检测波长：激发波长331nm,发射波长500nm

进样量：10ul

柱温：30℃

标准品色谱图：

样品色谱图：

    流动相PH值为4.05时，标准品色谱图:

    调整流动相PH值后，结果几乎无变化，说明这个样品检测时受流动相PH值影响也较小。

    通过以上几个实例我们不难看出，流动相pH值对有的样品检测影响不大，对有的样品影响较大，有时微弱的变化也可能会带来较大的差异。由于样品保留时间没有明显变化，那就说明PH值的这点变化对流动相的极性影响不大，也就是对流动相的洗脱能力影响不大。究其原因主要是流动相的酸碱度会影响某些物质离解程度，从而影响到该物质的活性，也就是该物质在某一PH值流动相下离解程度越强，该物质活性也越强，该物质被洗脱出来也越容易。另外有条件的话，在选择缓冲液pH值之前，我们应先了解被分析物的Pka，高于或低于Pka两个pH值单位的，有助于获得好的、尖锐的峰，从HH公式：pH＝Pka＋log（[A-]/[A]）得知，溶液pH值高于或低于Pka两个单位，化合物99％成分以一种形式存在，而一种形式存在的化合物才能获得好的尖锐的峰。

    结论：流动相PH值对有的样品检测影响不大，对有的（应该是少数的）样品影响较大。为了保证实验的顺利进行，我们配制流动相时应尽量按照参考方法要求配制。

    省时、省力、效果好必定是我们每个实验员所期望的结果，所以实验中的每个细小环节我们都应该高度重视，像流动相中PH值这样的小问题也不能例外。