主题:【第七届原创】香气香味化合物GCMS分析中的几种样品准备方法简介(三)--固相微萃取(SPME)

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香气香味化合物GCMS分析中的几种样品准备方法简介(三)---固相微萃取(SPME)

内容提要:
3.4.1固相微萃取 (SPME)基本原理
3.4.2固相微萃取(SPME)操作方法
3.4.3固相微萃取(SPME)特点
3.4.4固相微萃取(SPME)应用范围
3.4.5固相微萃取(SPME)操作条件选择
3.4.6固相微萃取(SPME)操作注意事项
3.4.7固相微萃取(SPME)定量方法
3.4.8固相微萃取(SPME)应用实例

3.4固相微萃取 (solid phase micro extraction, SPME)

固相微萃取(SolidPhase Microextraction,简写为SPME)是目前较为常用的香气香味提取技术,具有简单,快速,集采样、萃取、浓缩、进样与一体的特点。1990年由加拿大Waterloo大学的ArhturhePawliszyn首创,1993年由美国Supelco公司推出商品化固相微萃取装置,1994年获美国匹兹堡分析仪器会议大奖。

3.4.1固相微萃取 (SPME)基本原理

固相微萃取主要针对有机物进行分析,根据有机物与溶剂之间相似者相溶的原则,利用石英纤维表面的色谱固定相对分析组分的吸附作用,将组分从试样基质中萃取出来,并逐渐富集,完成试样前处理过程。在进样过程中,利用气相色谱进样器的高温将吸附的组分从固定相中解吸下来,由GC/GCMS来进行分析。

图  固相微萃取示意图

3.4.2固相微萃取(SPME)操作方法

有手动和全自动两种方式,下面以手动操作为例。

3.4.2.1样品萃取
①将SPME针管穿透样品瓶隔垫,插入瓶中。
②推手柄杆使纤维头伸出针管,纤维头可以浸入水溶液中(浸入方式)或置于样品上部空间(顶空方式),萃取时间大约2-30分钟。
缩回纤维头,然后将针管退出样品瓶

3.4.2.2 GC/GCMS分析
①将SPME针管插入GC/GCMS仪进样口。
②推手柄杆,伸出纤维头,热脱附样品进色谱柱。
③缩回纤维头,移去针管。



3.4.2.3全自动固相微萃取(SPME),自动提取和进样解析:


3.4.3固相微萃取(SPME)特点
简单,快速,集采样、萃取、浓缩、进样与一体。一般不需要有机溶剂。一般香气香味组分(挥发性特强的部分除外)提取比静态顶空的灵敏度高好多倍或能够提取出来。适用于几乎各种复杂基质体系中的挥发性香气香味物质的测定。高萃取率。较好的重复性(一定的严格条件下)。
香气香味组分的响应大小和回收率取决于待萃取材料的状态、香气香味的极性和沸点、萃取时间、温度、样品基质等。
绝对量测定较难些。复杂混合物的定量较难。对于单一或少数组分定量尚可以。

3.4.4固相微萃取(SPME)应用范围
样品比较和筛选,挥发性和半挥发性的测定等。各种复杂基质体系中的市场样品中香气香味化合物的鉴定测定。例如含蛋白质、植物油、动物油脂、蜡质、香波、沐浴露、洗衣粉或液、肥皂、各种食品材料、牙膏、口香糖、香辛料、植物或植物提取物、烟叶、水果制品等样品。也包括含油脂、蛋白质、糖水化合物的香精样品,特别是含油脂的咸味香精样品,以及含丙二醇,甘油等的水质香精样品的提取,主要是补充测定其它方法未测定到的一些含量极小的香精成分,例如某些痕量硫化物。但可能不是很适应含沸点很低的大量溶剂的样品。
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2014/11/18 22:40:32 Last edit by jimzhu 举报
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3.4.5固相微萃取(SPME)操作条件选择
固相微萃取(SPME)吸附效率的影响因素主要包括萃取头涂层(固定相)、萃取时间、萃取温度、加盐量和解析时间等。

3.4.5.1萃取头的种类及膜厚和长度
选用何种固定相应当综合考虑分析组分在各相中的分配系数、极性与沸点,根据“相似者相溶”的原则,选取最适合分析组分的固定相。常用的固定相有非极性PDMS(聚二甲基硅氧烷)极性PA(聚丙烯酸酯)CW(聚乙二醇)/DVB二乙烯基苯等。因为香气香味化合物既有极性化合物,也有弱极性或非极性化合物,所以一般最好选用极性和非极性的固定相相结合来满足不同极性化合物的提取要求,例如PDMS/DVBDVB/CAR/PDMS

一般萃取头的长度为1 -2cm,膜的厚度通常在10100 μm之间,小分子或挥发性物质常用厚膜,大分子或半挥发性物质常用薄膜,综合考虑试样的挥发性还可选择中等厚度。长度2cm的萃取头的灵敏度比1cm的高。

3.4.5.2萃取时间及溶液的搅拌速度
萃取时间即萃取达到平衡所需的时间由待分析物的分配系数、物质的扩散速率、样品基质、样品体积、萃取头膜厚等因素决定。一般萃取过程均在刚开始时吸附量迅速增加,出现一转折点后上升就很缓慢。因此,可根据实际操作目的对灵敏度的需求不同,适当缩短萃取时间。通过实验,一般对于香气香味成分提取时间大致40-60分钟左右。

磁力搅拌或振荡器可促使样品均匀,尽快达到平衡,一般能明显提高萃取效率,且转速越高,达到平衡的速度也越快,但不能过快。所以一般采用磁力搅拌或振荡器来加快样品提取速度。

3.4.5.3萃取温度
加热样品可以加速试样分子运动的速度,能使样品中的分析组分尽快从试样中释放出来,增加蒸汽压,提高灵敏度,对于顶空分析尤为重要。但过高的温度会降低萃取头固定相对组分的吸附能力。选择一个合适的温度非常重要

升高温度有利于香气香味物质在的扩散并缩短平衡时间,但同时也会使萃取头对香气成分的吸附量减少,影响SPME 的灵敏度。另外温度太高可能会使样品中香气香味物质发生化学变化,例如分解或转化等反应,对得到真实的样品香气香味风貌影响。

一般对于香气香味成分提取采用室温到60度左右不等。对于某些易变化不稳定的样品材料,例如新鲜水果蔬菜花朵等,可以在室温或低温下提取。对于挥发性差的香气香味组分可以通过提取温度例如40-60度,个别样品甚至80度,但温度过高,水质样品中的水蒸气比例增加,进入萃取头或在表面形成水膜而影响萃取和GCMS分析。

3.4.5.4加盐量
向液体试样中加入少量无机盐氯化钠、硫酸钠等无机盐可增强离子强度,降低极性有机物在水中的溶解度即起到盐析作用,能使更多的挥发性物质挥发至溶液的顶空(或直接液体插入法下进入萃取头),使萃取头能吸附更多的分析组分,提高香气香味物质的响应值。一般情况下可有效提高萃取效率,但并不一定适用于任何组分。因为同时盐(NaCl)的加入会影响基质粘度,降低分析物的扩散速度,产生盐的负效应,有些香气香味组分的响应值可能有所下降。加盐量的多少多不同香气香味组分的影响会有所不同,所以需要对NaCl 加入量进行优化,以得到多数香气香味组分能较好的响应值。一般香气香味液体样品加入2-3%左右量的盐。

3.4.5.5解析时间和解析温度
一般情况下1-3分钟,最长10分钟,绝对多数香气香味组分会解析出来,可以根据实验来确定解析时间。也可以把萃取头留在进样口(或老化器)来老化,以便下一个样品马上可以使用。对于香气气味样品,解析温度一般在250度左右。

3.4.5.6 加样量和顶空容器大小
增加样品量可以增加香气香味组分在顶空瓶上部的分量,等过多会影响平衡。一般在20顶空瓶中加入2-5样品(包括固体样品加水的体积)。其它容器适当调整加入样品量。鲜花、新鲜植物、蔬菜、水果只能是放在密闭容器中,并尽量放多一些

3.4.5.7 其它因素:极性溶剂的含量,样品的粘度,pH值,衍生化等
极性溶剂的含量:例如白酒或某些香精里面含大量乙醇(极性溶剂),会影响其它含量小的化合物进入萃取头,需要用水或盐水来稀释以减少影响。另外乙醇峰可能太大也会影响别的组分的测定。再例如,香精中丙二醇也有相同情况。

样品的粘度:如果样品的粘度过大,也会影响香气香味组分的挥发出来。例如丙二醇作为溶剂的香精,要适当用水稀释。油脂基质的样品也会有类似的问题,需要注意。

改变pH值:例如添加大量酸味剂、酸性防腐剂的样品,可能会减少某些物质的提取。可以用NaHCO3来中和,提高中性化合物的提取效率。有时候加酸可能会增加某些酸性化合物的提取,加碱可能会提供某些碱性化合物的提取(游离出来)。另外pH值能改变分析组分与样品介质、固定相之间的分配系数,对于改善试样中分析成分的吸附是有益的。

衍生化:衍生化反应可用于减小酚、脂肪酸等极性化合物的极性,提高挥发性,增强被固定相吸附的能力。不过用的不多。

3.4.6固相微萃取(SPME)操作注意事项

①使用萃取头前必须充分予以老化处理,老化后尽量立即使用。萃取头易碎,操作应格外小心,严格按操作程序进行。

②使用固相微萃取(SPME)的专用细径衬管,例如0.75-1mm内径的衬管,不使用2mm内径的衬管。

下面是使用GC的标准2mm内径衬管(红色)和0.75mm内径细衬管的色谱图的对比,可以看出普通衬管的峰型很宽,也分不开,而细径衬管的峰型良好,尖锐,分离好。(注:但两种衬管后面的峰型影响要小些)



③柱箱温度从较低温度,例如40度开始,并适当保持一段时间后再升温,这样使香气香味样品组分在柱子前段适当富集,以利于出来较好的峰型。

④对于高浓度的极性溶剂适当用盐水稀释,例如白酒(含大量乙醇)样品稀释5-10倍。

对于粘度高的样品,例如丙二醇为溶剂的香精也要稀释。

3.4.7固相微萃取(SPME)定量方法

由于香精样品和香气香味样品一般都是复杂的混合物,含的化合物种类个数多,要想每个化合物都一一绝对量测定含量较难些,比较麻烦,需要花较多时间。复杂混合物的定量较难。对于单一或少数组分定量尚可以。

由于固相微萃取属于一种动态平衡技术,因此定量需要对某些外部条件进行校正。

3.4.7.1外标法

分析香气香味组分较少的样品或针对某一或某些组分(例如含量小的硫化物的测定)的样品可采用外标法,将标准加至和样品相同的基质中进行固相微萃取,制作校正曲线,试样通过查找校正曲线上的点而定量。标样和样品的准备方法和测定条件要保持一致。不过选用绝对相同的基质有时候可能比较难。例如植物油样品就选用相同的植物油做为标样溶剂来做曲线,酒样选用酒精水溶液作为标样溶剂来做曲线。



(选自欧阳钢锋老师图例)

3.4.7.2标准添加法
有时候往往难以找到和样品相同空白基质或不知道何种基质,外标法就不会使用。样品的基质比较复杂的样品一般使用标准添加法或内标法。使用标准添加法需注意,试样中的分析组分不一定能象加入的标准那样容易被提取,分析时要筛选条件保证分析组分的提取率。



3.4.7.3 内标法





3.4.7.4 复配校正法

用固相微萃取(SPME)测定得到香精样品或最终样品的相对量比数据(和实际数据不一样,挥发性强组分的比例高,挥发性组分低比例低,极性不同响应比例也不同)。然后简单复配,再利用前后的数据进行校正。

3.4.8固相微萃取(SPME)干扰物

做固相微萃取(SPME)可能会发现在色谱图上会有一些和目标物或待测物无关的干扰峰。这些峰会在一般都会在固定的位置或保留时间出现,很有规律。有时候也不一定能检索到出他们是什么化合物。有时候会和目标物相重合。在痕量检测时候,有时候会造成对目标物的干扰。有时候会误认为是一种未知成分,增加成分鉴定工作量。

顶空提取的空气干扰

一般在最前面的地方,并且是一段距离,不是一个单峰。

来自固相微萃取萃取头(Fiber)的流失

涂布在萃取头纤维上面的固定相在进样口受热,或受提取环境的空气、水和其它物质的影响,可能会出现一定的流失。流失多为(环)硅氧烷类化合物,一般会在整个色谱图范围的许多地方出现

苯系列化合物

苯系列化合物可能是由固定相(例如DVBPDMS等)脱落的碎片,主要有苯、甲苯、二甲苯、三甲苯,乙基丙基苯等。但注意有时候可能真的来自样品本身。所有用SPME做苯系列化合物的测定可能不是很合适。

其它干扰物(来自萃取头和样品基质)

这些干扰物有各种酯、未知物等。例如油脂分解的醛,烃类化合物等,碳水化合物分解的呋喃糠醛类化合物。

下面是某一次的SPME空白色谱图。一般要做空白,了解本底干扰情况。



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2014/11/18 22:42:53 Last edit by jimzhu
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3.4.8固相微萃取(SPME)应用实例

实例1 红油麻辣火锅锅底香气香味成分

样品提取:取2.5g从现场取来火锅锅底于20ml顶空瓶中。置于全自动固相微萃取的进样装置。平衡时间:10min, 提取温度:60度,提取时间:30min,解析温度:250度,解析时间1min。萃取头:DVB/CAR/PDMS65μm,2cm

GC/MS条件
色谱条件:
色谱柱:安捷伦HP-Innowax (60m×0. 25 mm ( i.d.)×0.25μm)毛细管柱;
升温程序:40保持2 min,以5 /min升至250,保持26 min
载气(He, 纯度99.999%以上)流速1.8 mL/min;
进样口温度250,分流进样,分流比1:1;

质谱条件:
电子轰击(EI)离子源;电子能量70eV;传输线温度280;离子源温度230;四杆温度150SCAN扫描范围:29-400

红油麻辣火锅锅底香气香味成分TIC

实例2 苹果的香气成分

把苹果切开,取出2g带皮的果肉,快速切碎,放在20ml顶空瓶中,加入2g饱和盐水(减少褐变,增加提取香气的效率),并充入少量氦气,盖紧瓶盖。置于多功能进样器的全自动固相微萃取的进样装置上面。平衡时间:5min,提取温度:不加热,提取时间:30min,解析温度:250,解析时间:1min。萃取头:DVB/CAR/PDMS65μm, 2cm

色谱条件:

色谱柱:安捷伦HP-Innowax(60m×0. 25 mm ( i.d.)×0.25μm)毛细管柱;

升温程序:40保持2 min,以5 /min升至250,保持26 min

载气(He,纯度99.999%以上)流速1.8 mL/min;

进样口温度250,分流进样,分流比1:1

质谱条件:
电子轰击(EI)离子源;电子能量70eV;传输线温度280;离子源温度230;四级

杆温度150SCAN扫描范围:29-400



苹果的香气成分TIC

实例3 某桃味果汁的固相微萃取的质谱总离子色谱图(部分)



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2014/11/18 22:54:00 Last edit by jimzhu
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实例4 毛血旺香气香味分析

采用现场取样提取。在厨师烹饪过程,把固相微萃取的萃取头放正在烧菜的锅的上方,从开始到烹饪完成一直进行提取,总共约8分钟左右。结束后立即回到实验室,在GCMS进样口解析。解析温度:250度,解析时间1min。萃取头:DVB/CAR/PDMS65μm, 2cm



实例5 某一咸味香精(火腿香精)

样品提取:0.5g火腿香精20ml顶空瓶中。置于全自动固相微萃取的进样装置。平衡时间:10min, 提取温度:60度,提取时间:30min,解析温度:250度,解析时间1min。萃取头:DVB/CAR/PDMS65μm,2cm


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2014/11/26 21:52:07 Last edit by jimzhu
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正是缺乏学习资料,打瞌睡送枕头呵,在这个论坛里在朱老师处获益良多啊,先睹为快
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一套SPME包括进样衬管,价格区间在什么范围?另,如果要测邻苯,SPME专用衬管要更换成采用的衬管吗?
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原文由 GRANT(fatinsect) 发表:
一套SPME包括进样衬管,价格区间在什么范围?另,如果要测邻苯,SPME专用衬管要更换成采用的衬管吗?


手动SPME全套估计在近一万元左右。要测定邻苯或香精样品,必须换成普通衬管。
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一套SPME包括进样衬管,价格区间在什么范围?另,如果要测邻苯,SPME专用衬管要更换成采用的衬管吗?


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教程图文并茂,十分详细,向朱老师学习!
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这些是必需的,另外萃取操作台什么的看是否需要了
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一套SPME包括进样衬管,价格区间在什么范围?另,如果要测邻苯,SPME专用衬管要更换成采用的衬管吗?


手动SPME全套估计在近一万元左右。要测定邻苯或香精样品,必须换成普通衬管。
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这些是必需的,另外萃取操作台什么的看是否需要了
谢提供,这些是最基本的,加上磁力搅拌器,架子等。
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朱老师大作必须看啊,有好多学习的地方;今年我们才正式用手动的SPME,效果不是很好,方法还在摸索中;不过我们用30mHP5的柱子,可能没有Innowax柱子好吧?