LC色谱的定性与定量: 1、 色谱的定性: 利用已知物直接对照法定性:依据:在一定的柱条件(柱长、固定相)、操作条件(柱温、流动相组成、流速、检测器条件)下,组分有固定的保留值。因此,控制条件一定,比较已知物和未知物的保留时间,就可方便地确定某一色谱峰是什么物质。常用有以下两种方法: a. 利用保留时间和保留体积定性 b. 用已知物增加峰高法定性 但用上述方法进行定性,往往不准确,(中草药组成复杂)一些厂家二极管阵列检测器独有的三维谱图和峰纯度鉴定功能可避免这个问题。 2、 色谱的定量: 根据组分的含量与检测器的响应信号(峰面积、峰高)成正比,色谱的常用定量方法可分为以下几种: a. 面积百分比法: 当没有现成的对照品,且假设检测器响应都相同,所有的组分都流出,所有组分都被检测到时,可用此法。但此法不准,尽量不用。 b. 外标法:外标法是用纯物质配制成不同浓度的标准样品,在一定操作条件下定量进样,测定不同浓度标准样品的峰面积,绘出浓度对峰面积的标准曲线。进行样品分析时,在与标准样品严格相同的条件下定量进样,由所得峰面积可以在标准曲线上查出被测组分的含量。当被测试样中各组分浓度变化范围不大时,可用单点校正法,即配制一定和待测组分含量十分接近的标准溶液,定量进样。此法假定标准曲线是通过坐标原点的直线,因此可用一点决定直线的斜率,故称单点校正法。
组分含量= 样品峰面积×对照品浓度/对照品峰面积
c. 内标法: 当试样中某些组分不能流出色谱柱或只需测定试样中几个组分时,可用此法。内标法是在一定量的样品中,加入不定量的内标物,根据待测级分和内标物的峰面积及内标物质量计算待测组分质量的方法。内标法可消除操作条件变化所引起的误差,故定量校准确。但内标物的选择至关重要,需满足以下条件: 应在试样中不存在的物质,能溶于样品且与样品中各组分能分离开,加入的量与待测组分相近,而且内标物与待测组分色谱峰位置相近。 缺点:每次分析都要准确称取试样和内标物的质量,不宜于作快速控制分析。