主题:【第八届原创】DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳操作分享(仅代表个人实验习惯)

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同样是电泳,但是DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖电泳在操作上有很大的区别。相比之下,琼脂糖凝胶操作简单很多,只需要准备好制胶槽和梳子,融好胶后加一点核酸染料后,倒入制胶槽,然后点样,电泳,即可显示,时间大概在1个小时左右就可以了。而DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳,先要洗板子,然后用乙醇擦板子,用硅化剂和反硅化剂擦,再制胶,然后预电泳,期间要插梳子,缓冲液热了后,点样电泳,电泳完后,下板子染色15分钟,最后显色。这一系列步骤听下来都有些复杂,所以有必要把该方法整理下来,标注好实验关键点。
以下自己对聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验总结,虽然步骤大体上和其他网上搜的一致,但是不同实验室甚至个人对于一个实验操作都会有不同,所以我把自己的拿出来和大家一起分享,重点在于一些小细节操作。
一 聚丙烯酰胺凝胶的制备
根据分离DNA片段的大小及需凝胶的容积,配制聚丙烯酰胺凝胶.
1玻璃板清洗:NaOH溶液浸泡玻璃板一定时间,想要快的话可以用开水浸泡,将剥离板上的胶铲除,用去污剂(洗洁精也可)和清水清洗干净,最后用双蒸水冲洗两遍,垂直放置,晾干(清洗短长板的工具要分开)。
2 用滤纸蘸取95%乙醇擦拭长短板,5分钟待乙醇挥发后。分别用脱脂棉蘸取硅化剂和反硅化剂均匀擦拭长短板。
2.固定玻璃板:5分钟之后,把两个封条分别置于长板处理面两侧,短板处理面向下盖到长板上,两侧用夹子固定,准备好梳子,调整板子的平衡,使板子和台面保持水平。
3配制胶溶液(5%): 原胶: 8.34ml;尿素: 45ml; 5xTBE:15ml;双蒸水:6.66ml; 尿素在室温难溶解,这一部分胶先配好在55℃水浴中预热,溶解完后过滤,制胶时再加入TEMED: 30ul;过硫酸铵: 200ul
4灌胶:缓缓地使胶溶液倒入两板间,等胶溶液布满整个板子时,倒插梳子,用夹子夹紧使梳子和玻璃博间没有缝隙从而防止点样时串样,整个过程不要产生气泡。
5.凝固:灌完胶后,放于室温让其自然凝固,观察胶边沿出现折射线就表明胶以凝固。
二 聚丙烯酰胺凝胶电泳

1.固定玻璃板于电泳仪:取掉玻璃板上的夹子,拔下梳子,除去长板点样处的胶,用清水冲洗干净玻璃板,短板向里固定于电泳仪支架上,即凹口板面向电泳液。
2.插梳子:取5xTBE200ml稀释到1000ml制成1xTBE。向电泳仪下端槽内倒1xTBE约500ml,向上槽倒1xTBE,使液面高于短板上沿。用10ml的枪吸打缓冲液吹除插梳子除的废胶,插好梳子,点3ul 上样缓冲液,观察点样孔是否串样,如串样再调试梳子。
3 预电泳:打开变压器,调节电压为1800V,功率100W,电流100A,预电泳大约40min至玻璃板热。
4 样品变性:12ul体积的样品中加入6ulLoading Buffer,沸水浴5min,迅速放于冰上冷却。
5电泳: 吸取3-4ul 变性后的样品,按顺序点样。调节电压为1800V,功率100W,电流80A,电泳大约1h。
6 卸玻璃板。电泳完毕,关掉电泳仪,放出缓冲液,取下玻璃板,卸下短板、梳子、封条,只留下长板和上面的胶。

三 聚丙烯酰胺凝胶电泳的显色----银染
1.洗胶:把长板置于双蒸水中清洗一次。
2.染色: 染色液 硝酸银: 1.5g(0.1%);37%甲醇:2.25ml;加双蒸水至1.5L。把长板放在染色液中15分钟。
3 洗胶:从染色液中拿出长板后,于双蒸水中清洗一次,该步骤动作要迅速。
4.显色:显色液 碳酸钠: 45g(0.03g/ml); 37%甲醛: 2.25ml(0.15%);硫代硫酸钠:300ul(10mg/ml);加双蒸水至1.5L。把清洗干净的胶板置于盛有显色液的塑料盘中显色。显色时间根据条带和背景颜色深浅调整,达到DNA条带清晰的目的。
5.终止显色:在水龙头下冲洗板子,防止胶被烧而无法读带。
7.干胶:胶板置于室温自然干燥。
自己跑的板子
上图是自己按操作跑的板子,所有的实验操作都需带好手套,口罩,注意实验安全。板子读完后拍照保存,及时泡于NaOH溶液中。
对于同一个实验每个实验室在有些步骤上会不同,所以本文也仅限拿出来分享而已。
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