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主题:【已应助】UPLC梯度洗脱重现性极差,已从多方面排查,求各位师兄指点!

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kanhama
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各位师兄好。
身为一名实验猿,能有如此平台同各位师兄交流,感谢此平台。同时在下在仪器信息网也学到许多知识,遇到些许问题与众位进行探讨,列位师兄热情指点,犹为激动。话不多说,如今遇一棘手难题,在下着实难以解决,特来寻求帮助,还请各位师兄不吝指点!
在下手头有台waters UPLC H-class,配TUV、FLR检测器。
常用此仪器做水溶性维生素VB族b1、b2、b6、叶酸。b1、b6、叶酸三物质TUV出峰,b2为FLR出峰。
近日发现,梯度洗脱TUV重现性极差,可以说是10针只有4-5针是正常出峰图谱,而不靠谱的图谱中在需要的时间段是一条平线。
此现象是一阵一阵的出现,经常是今天往死了折腾都是不靠谱;明天,同样的流动相,同样的样品,图谱完美,重现性极好。
在下分步排查,1)怀疑过比例阀问题。软件端显示已梯度,有机相越来越高,实际比例阀故障,一直是水相在冲柱,如此可以解释不靠谱图谱为何是基线,洗脱能力弱,洗脱不下来嘛。按照这个思路排查,将常用CD通道换成AB通道,故障依旧。另外梯度时盯着控制台,发现有机相水相比例曲线还是看上去像那么回事的,对此部分还是存在疑问。
2)怀疑进样系统问题。用过UPLC的师兄知道(没有任何歧义,小弟是半路出家,边用边学),UPLC的控制台样品管理器有“定性针头密封”“密封状态测试”“渗漏测试”三个测试,在下把这三个测试都走了遍,均显示通过状态;另外走等度洗脱进了6针洛伐他汀的对照,峰面积RSD很是不错。对此部分暂时没有疑问。
3)怀疑色谱柱有问题。更换了预柱,更换后第一针跑出来的图谱是正常所需图谱,(没换预柱之前是针针不靠谱,针针走基线)但是第二针开始又是走基线。因为VB的色谱条件梯度前期水相比例达到97%,手头只有那一根色谱柱,我担心换别的柱子97的水太高,柱子吃不消,所以这个色谱条件没有替换柱子排查是不是柱子的原因。但是我换过色谱系统,换过检测项目,就是之前提到的洛伐他汀(等度洗脱),做了个留样再测,测得值与当初值略低(一年前产品,可以接受);同时VB柱用于此系统也能出洛伐他汀的峰,由于时间关系并未验证VB柱所测样品含量。总结一二,换过预柱,无明显效果;换过色谱柱,等度洗脱可正常使用。是否是色谱柱问题,请看下段。
4)怀疑检测器问题。之前说过,此色谱条件b1、b6、叶酸三物质TUV出峰,b2为FLR出峰,如今TUV紫外检测器出现重现性极差的问题,那串联的FLR荧光呢?在下本着这个思路,查看了荧光的图谱。因为产品是多种维生素片(题外话,是何产品就不做广告了,以后再探讨这部分内容,我们接着将问题),维生素为上海某厂家提供的多种维生素预混料,原料我是都测过的,符合出场报告,那么现在紫外没有峰,可以理解为没有投料吗?非也。因为根据荧光图谱,b2含量符合企业标准,从而应证上面提到的色谱柱问题,个人觉得色谱柱分离效果没有问题,色谱柱那段疑问可以放下,如果色谱柱存在问题那FLR荧光也不会正常出峰。
其实就检测器这段我也咨询过售后,售后让我查看下灯能量,在售后指点下我于230nm处,流通池纯甲醇,查得灯能量 样品/参比为 60/109,比值约为55%,售后工程师说灯能量比值最好在70%,建议我冲洗参比池。我已用纯水,纯甲醇冲洗,但效果仍不明显,明天打算换异丙醇、30%硝酸冲洗。
现在怀有一疑问,梯度重现性差是不是因为流通池脏导致?那为何等度就没有此问题?
流水账似的说了这么多,总结一二。就输液系统、进样系统、分离系统、检测系统四部分进行排查,各细节见上,但是还是没有头绪,如果哪位师兄有什么建议还请指出,另外就在下那个疑问,有类似经验的师兄还请指点一二!我在这里先谢过了!
另外,有一工程师指出,他怀疑是哪个阀关不紧,时灵时不灵导致重复性差,我对阀的认识只停留在v1v2v3v4,哪个对应什么作用还没理清,提出这个可以给各位师兄一个思考的头绪。
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老多_小多
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如果你是做这个不行,还可以考虑换另外一个梯度方法来验证,如果重现性不好,肯定是仪器有问题了,找原因也比较麻烦,就像你说的阀,一般都是工程师才判断的出来
kanhama
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原文由 老多_小多(emoc98311) 发表:
如果你是做这个不行,还可以考虑换另外一个梯度方法来验证,如果重现性不好,肯定是仪器有问题了,找原因也比较麻烦,就像你说的阀,一般都是工程师才判断的出来


今天把检测器用水反冲了下,临下班了看了看灯能量,还是只有55%。
明天打算用异丙醇再冲冲,争取把灯能量这个问题解决。
今天又打电话给售后了,也跟工程师反应了梯度洗脱没峰,等度洗脱有峰,工程师表示也百思不得其解,
我说我现在报修都不知道保修哪个部分啊,工程师说你再折腾折腾,实在不行让工程师上门排查。
我会把每日排查进度都放上来跟大家交流,希望能够尽快把仪器问题解决,正常实验。
dywzqbx
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进样器不灵活,出现卡主的情况,仅属于个人猜想,可能性极小。简单样品连续6~10针测定峰面积RSD,或者是走一个自动进样器线性检测,或者是测定进样器精度,http://bbs.instrument.com.cn/topic/4838369,可做参考。
比较想知道你最后会怎么解决,期待你的更新
liuwei10987
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你的液相条件是什么梯度,流动相是否加了缓冲盐?初始水相比例97%,平衡时间要稍长一些。注意观察系统压力,每一针的平衡时的压力、梯度运行时的压力变化。若每一针的压力变化一样,说明泵没有问题。不连色谱柱,直接进样几次,测试进样阀和检测器是否有问题。重新配置流动相,看是否是流动相的问题。逐一排查一下。
kanhama
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各位好,我又来了。
今天周日,厂里加班,有空我又试了试机子。
楼上有位师兄说测测RSD,我其实上次测过荧光的RSD,0.8%,
两个检测器是串联使用,梯度洗脱如果有问题的话那荧光的出峰时间应该会有变化,可是现在没有这个现象。
上周五我做色素的时候同时也用UPLC试了试,
发现色素紫外能够出峰,第一针峰型很好。可以排除检测器问题,灯能量不行照样能出峰。
后来发现一个问题,
色素为4个物质混标,柠檬黄、靛蓝、日落黄、诱惑红(出风顺序)
同一小瓶,重复进样,
日落黄跟诱惑红出峰较稳定,前两个色素柠檬黄、日落黄经常容易搅在一起
有些怀疑泵输液系统存在问题,还需继续排查。
初步怀疑比例阀,可是如果比例阀有问题那为何荧光的出峰时间及峰面积都具有极好重现性?
PJ000
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我也是用UPLC H Class型仪器,测氨基酸,也出现了这种情况,同样的样品、同样的洗脱梯度,基本只有一个出峰,其他几次试的都是没峰的
夏天的雪
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原文由 PJ000(v3248422) 发表:
我也是用UPLC H Class型仪器,测氨基酸,也出现了这种情况,同样的样品、同样的洗脱梯度,基本只有一个出峰,其他几次试的都是没峰的
其他项目是否正常,如果正常,考虑衍生问题
PJ000
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原文由 夏天的雪(bingwang228) 发表:
其他项目是否正常,如果正常,考虑衍生问题


恩,谢谢。
流动相是换过的,柱子也洗过,用其他柱子测定其他样品可以正常出峰。
柱子昨天才洗过的,今天准备再试一下,如果不行的话,只能重新衍生样品,主要衍生剂的有时间限制,比较麻烦,
还有就是仪器是PDA检测器,已经超时了,但是还在继续用,这两天一直有通讯失败的现象。不知道和这个有没有关系啊?
夏天的雪
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原文由 PJ000(v3248422) 发表:
恩,谢谢。
流动相是换过的,柱子也洗过,用其他柱子测定其他样品可以正常出峰。
柱子昨天才洗过的,今天准备再试一下,如果不行的话,只能重新衍生样品,主要衍生剂的有时间限制,比较麻烦,
还有就是仪器是PDA检测器,已经超时了,但是还在继续用,这两天一直有通讯失败的现象。不知道和这个有没有关系啊?
灯能量不足也会有影响的,会基线噪音变大,有些浓度小的物质不能出峰