主题:【第八届原创】人凝血因子VIII中氨基酸含量测定

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青林
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8月一等奖
                                                                                        人凝血因子VIII中氨基酸含量测定
摘要  目的: 建立用高效液相色谱法测定人凝血因子VIII中氨基酸含量。方法: 采用6 - 氨基喹啉- N - 羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯( AQC) 为衍生剂,与氨基酸柱前衍生后,用Agilent 1200 高效液相色谱仪,AccQ·Tag C18柱( waters 150 mm ×3. 9 mm,4 μm) ,以水Eluent( 醋酸盐- 磷酸盐缓冲液) 稀释液和乙腈进行梯度洗脱,检测波长为248 nm,柱温37 ℃,进样量10μL。结果: 各氨基酸在32 min 内测定完毕,回收率为98.7% ~ 101.5%。RSD 均小于1. 5%。结论: 本法分离度好,快速、简便,可作为产品的质量控制方法。
关键词: 6 - 氨基喹啉- N - 羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯; 人凝血因子VIII; 甘氨酸; 衍生物; 梯度洗脱; 高效液相色谱法;氨基酸; 含量测定
凝血因子VIII,本品对缺乏人凝血因子礓所致的凝血机能障碍具有纠正作用,主要用于防治甲型血友病和获得性凝血因子Ⅷ缺乏而致的出血症状及这类病人的手术出血治疗。
该药物制备过程中使用了氨基酸( 精氨酸、丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、盐酸赖氨酸、脯氨酸 等) 做稳定剂,为了保证药品质量和用药安全,应对其中氨基酸的含量进行控制。该法依据过量的6 - 氨基喹啉基- N - 羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯( AQC) 在一定条件和氨基酸形成稳定的衍生产物( 柱前衍生) ,用高效液相色谱法测定衍生产物,根据衍生产物的含量计算人凝血因子中各氨基酸的含量。

1 仪器和试药
1200 高效液相色谱系统( 美国Agilent 公司) ,配置低压四元梯度泵、1314B 紫外吸收检测器、自动进样器、柱温箱、Chemistations 化学工作站; Sartorius CP225D 电子微量天平( 德国Sartorius 公司) ; SartoriusPB - 21 型pH 计( 德国Sartorius 公司) ; LDZ5 -2 低速自动平衡离心机( 上海医用离心机厂) 等。

各标准品均来自于中国食品药品检定研究院


2 色谱条件及系统适用性试验
色谱柱: Waters AccQ·Tag C18色谱柱( 3. 9 mm ×150 mm) ; 流动相: 水为溶剂D,Eluent( 醋酸盐- 磷酸盐缓冲液) 稀释液( A) - 乙腈( B) - 水( D) ,柱温:37 ℃; 检测波长: 248 nm。精密量取对照品溶液与供试品溶液10 μL,分别注入液相色谱仪,记录色谱图32 min。梯度洗脱条件表见表1。




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青林
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3 溶液制备
3. 1 Eluent( 醋酸盐- 磷酸盐缓冲液) 稀释液称取三水乙酸钠190. 4 g,加注射用水1000 mL,搅拌,溶解,用稀磷酸将pH 调至5. 2,加入乙二胺四乙酸二钠溶液( 称取乙二胺四乙酸二钠100 mg,加注射用水100 mL,摇匀使其溶解) 10 mL,加入叠氮化钠0. 1 g 及三乙胺23. 7 mL( 17. 2 g) ,用稀磷酸滴定至pH 4. 95,用0. 45 μm 的滤膜过滤,于4 ℃储存,备用( 此条件下可保存6 个月) 。量取该溶液100 mL,加注射用水稀释至1000 mL,混匀,即得Eluent( 醋酸盐- 磷酸盐缓冲液) 稀释液。
3. 2 对照品储备液混合对照品储备液精密称取各氨基酸对照品适量,置同一100 mL量瓶中,以注射用水溶解并定容至刻度。制成含氨基酸含量均含5. 0 mg·mL - 1 的混合对照品溶液,即得。
单个对照品储备液: 精密称取各含氨基酸的各对照品适量,分别置100mL 量瓶中,用注射用水溶解并定容至刻度。制成分别含各氨基酸的单个对照品溶液,即得。
3. 3 供试品储备液
3. 3. 1 加样回收率试验溶液精密称取各氨基酸各0. 3200,0. 4000,0. 4800 g 和辅料适量,加人凝血因子VIII原液7. 5 mL,肝素钠适量,用1. 0 mol·L - 1 盐酸调pH 至6. 9,加0. 01 mol·L - 1枸橼酸三钠溶液溶解并定容于20 mL。分别制备成16. 0, 20. 0, 24. 0 mg·mL - 1溶液。
3. 3. 2 空白溶液  按公司处方,加入辅料的混合物,用注射用水制备各空白溶液
3. 4 内标溶液精密称取α - 氨基丁酸( AABA)0. 4 g,加注射用水定容至100 mL。
4 氨基酸衍生方法
4. 1 精密量取供试品储备液、样品及对照品储备液各1. 0 mL,加1. 5%磺基水杨酸9. 0 mL,混匀静置2 h以上, 3000 r·min - 1离心10 min,留取上清液。
4. 2 精密量取“4. 1”项下上清液1. 0 mL( 其中对照品储备液对应上清液分别精密量取0. 06, 0. 4,0. 8,1. 0, 1. 2, 1. 6 mL) ,分别置10 mL 量瓶中,用注射用水定容。制备成供试品溶液、样品溶液及浓度分别为1. 5, 10. 0, 20. 0, 25. 0, 30. 0,40. 0 mg·mL - 1 的对照品溶液。
4. 3 精密量取“4. 2”项下溶液各100 μL,分别加注射用水0. 4 mL 及内标溶液20 μL,混匀备用。
4. 4 精密量取“4. 3”项下溶液30 μL 放入衍生管中,加硼酸缓冲液( pH 8 ~ 10) 210 μL 涡旋混合,并加入AQC 衍生剂60 μL 涡旋混合15 s,即为各供试品溶液,待用。
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2015/9/4 17:43:52 Last edit by zzz23010402
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怎么这么奇怪,明明是我发的帖子,怎么变成“微雨燕双飞”的帖子了
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2015/8/31 18:46:04 Last edit by wyqql2060
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人凝血酶原复合物人凝血酶原复合物,在20min左右有峰甘氨酸标准甘氨酸标准磺基水杨酸+a氨基丁酸磺基水杨酸+a氨基丁酸
盐酸精氨酸标准盐酸赖氨酸标准
脯氨酸标准组氨酸标准(含有脯氨酸杂质,并且组氨酸峰和甘氨酸峰重合)
空白溶液
混合标准(本来应该有6中峰,但由于甘氨酸和组氨酸峰重合,只有5个峰,15min,20min,22min,23min,24min)。15min峰是甘氨酸和组氨酸的合并峰。
人凝血因子VIII(制剂只有组氨酸)
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2015/9/1 8:18:20 Last edit by wyqql2060
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5 方法与结果
5. 1 色谱系统的适用性评价和氨基酸的定性鉴别
对混合对照品溶液、单个对照品溶液、空白溶液进行衍生处理后,分别进样,记录色谱图。比较得到各氨基酸对应的峰位。除甘氨酸和组氨酸峰重合不能区分外,其余均可以有效分离。
5. 2  本方法下,对各标准的回收率进行测试,,回收率为98. 7% ~ 101. 5%。RSD 均小于1. 5%(具体的数据就不上了)。有较好的应用性,且线性良好,r值均大于0.9990.
5.3 如果辅料中同时混有甘氨酸和组氨酸,则本实验将无法进行准确定量。故有一定的局限性。
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2015/9/1 8:16:32 Last edit by wyqql2060
土老冒豆豆
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这个人凝血因子已经被青林吃透透了吧。
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原文由 土老冒豆豆(土老冒豆豆) 发表:
这个人凝血因子已经被青林吃透透了吧。


我也只负责一部分而已
这个方法还要改,甘氨酸和组氨酸没分开
浪淘沙隐
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为毛要用这么复杂的方法,又是醋酸盐,又是磷酸盐,又是三乙胺,还有叠氮化钠和EDTA,流动相也用了3相
小虾米
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原文由 浪淘沙隐(zhoujin83) 发表:
为毛要用这么复杂的方法,又是醋酸盐,又是磷酸盐,又是三乙胺,还有叠氮化钠和EDTA,流动相也用了3相


这是结合药典的方法,主要是一些氨基酸的峰不好分离
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2015/9/9 13:01:16 Last edit by zhoujin83
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原文由 小虾米(wuxia330) 发表:
实验都还没有完善的呢?
准备弄两个续集!