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液相色谱（LC）
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主题：【求助】求助~~~确定不了哪个是样品峰

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dxl_2007
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发表于：2016/06/21 10:05:47 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
现有标准物质3,5 - 二叔丁基4 - 羟基苯甲酸（纯度>98%）,用乙酸乙酯/正己烷（75:25(v/v)）混合物溶解，配成标样.

下表是分离条件：


泵：四元梯度泵


定量环：10µl


Hamilton 702SNR (25  ul) Syringe,50ul注射针

针头式过滤器：带聚四氟乙烯膜（0.45µm）。



色谱柱：
材料：
固定相：
柱长 x 柱内径
柱温：

不锈钢

LiChrosorb RP 18-7μm，

250mm×4mm

50℃



检测器：
类型

DAD
检测波长：

273nm
注：若检测低浓度（（5-10 ppm的溶液中））Irganox 1076，为了获得更好的灵敏度，紫外检测仪波长应设定在278 nm。



注 5
为了检测低浓度（（5-10 ppm的溶液中））Irganox 1076更好的灵敏度，紫外检测仪波长应设定在278 nm。



流动相：
组成：
流速：

水、乙腈、异丙醇

1ml/min

洗脱梯度：

时间（min）

水（%）

乙腈（%）

异丙醇（%）

5

5

65

30

9

5

65

30

10

0

65

35

14

0

65

35

25

12

88

0

    

浓度为50ppm的标样，在上述表格条件下分离，其色谱图是


图1


将溶剂乙酸乙酯/正己烷（75:25(v/v)）作为标准样品进样，在上述操作条件下没有明显吸收。即溶剂不影响样品峰的分离。
怀疑是正己烷在流动相中溶解性不好，增大流动相中异丙醇的含量，洗脱梯度改为

洗脱梯度：

时间（min）

水（%）

乙腈（%）

异丙醇（%）

0.1

5

65

30

5

5

65

30

10

0

65

35

14

0

65

35

20

5

65

30

    

其谱图为（标样250ppm）

图2
问题：1、在同一的色谱条件下，改变标样的浓度，确定不了哪个是样品峰。照一般情况，应该是图中最大的峰为样品峰，但从上面的色谱图来看，看不出哪个是样品峰。
  2、两个色谱图中三个大峰的前两个，怎么也分不开。
3、三个大峰的重复性都非常不好。
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2016/6/21 11:01:52 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
低浓度下样品就没有完全分离，换更大的浓度没意义吧。你这个应该重新开发方法梯度，先让样品中三个峰能完全分离，再去确定物质。
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支点
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2016/6/21 11:11:17 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
先用一个中高洗脱能力的等度试试看，比如用100%乙腈做流动相，用100%乙腈溶解标准物质（多少会溶解一点的）
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夏天的雪
bingwang228
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2016/6/21 11:25:28 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
找了一篇文献，可以参考一下里面的分析方法
附件：
3_5_二叔丁基_4_羟基苯甲酸高效液相分析方法的建立.pdf
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夏天的雪
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2016/6/21 11:28:24 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
第一张图中5min出的峰不是待测物质吗？不同浓度下，能否找到对应的峰成比例呢
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有水有渝
xky0230699
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2016/6/21 15:13:15 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
楼主的方法来源哪里，比较奇怪，反相柱用正相洗脱体系？如果原有方法不是标准方法，建议先参考“3_5_二叔丁基_4_羟基苯甲酸高效液相分析方法的建立”
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dxl_2007
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2016/6/21 16:41:48 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 支点(zhx_fs_ln) 发表:
先用一个中高洗脱能力的等度试试看，比如用100%乙腈做流动相，用100%乙腈溶解标准物质（多少会溶解一点的）
我用乙腈当溶剂试过，在乙腈中可以溶解，出来的峰前两个还是分不开。我想不明白的是，标准物质就一种，怎么出来两个大峰，按理说一般主峰比较大，其他杂质峰应该很小猜对
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dxl_2007
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2016/6/21 16:42:37 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 超级修理工(m3117845) 发表:
低浓度下样品就没有完全分离，换更大的浓度没意义吧。你这个应该重新开发方法梯度，先让样品中三个峰能完全分离，再去确定物质。
前面两个峰怎么也分不开
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dxl_2007
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2016/6/21 16:45:46 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 夏天的雪(bingwang228) 发表:
第一张图中5min出的峰不是待测物质吗？不同浓度下，能否找到对应的峰成比例呢
开始也认为5min那个峰是我要的峰，后来调整梯度发现5min以前还有为分开的大峰。关键是不同溶度下，对应的峰面积都在变化。而且所能比例与溶度比例对不上。
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dxl_2007
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2016/6/21 16:50:53 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 有水有渝(xky0230699) 发表:
楼主的方法来源哪里，比较奇怪，反相柱用正相洗脱体系？如果原有方法不是标准方法，建议先参考“3_5_二叔丁基_4_羟基苯甲酸高效液相分析方法的建立”
这个是工艺技术商给的，不是什么标准。以后我的样品是固体颗粒，必须用乙酸乙酯和正己烷当溶剂把里面的抗氧剂萃取出来进行测定。原方法是用内标，3，5二叔丁基4羟基苯甲酸是内标物。我想改成外标。抗氧剂的标准物资还没有到，我就现用3，5二叔丁基4羟基苯甲酸当样品试试在给定的条件下能不能出峰并把他分离开来。
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超级修理工
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2016/6/21 22:27:06 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 dxl_2007(dxl_2007)发表:
原文由  有水有渝(xky0230699) 发表:
楼主的方法来源哪里，比较奇怪，反相柱用正相洗脱体系？如果原有方法不是标准方法，建议先参考“3_5_二叔丁基_4_羟基苯甲酸高效液相分析方法的建立”
这个是工艺技术商给的，不是什么标准。以后我的样品是固体颗粒，必须用乙酸乙酯和正己烷当溶剂把里面的抗氧剂萃取出来进行测定。原方法是用内标，3，5二叔丁基4羟基苯甲酸是内标物。我想改成外标。抗氧剂的标准物资还没有到，我就现用3，5二叔丁基4羟基苯甲酸当样品试试在给定的条件下能不能出峰并把他分离开来。
我也觉得他这个方法有问题，开始觉得改梯度也许能分开，但是觉得溶剂用正相，柱子是反相真是没见过。希望楼主再确认吧，要是做出来也让我们涨涨知识。
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