主题：【分享】聊一聊激光散射

精盐做单方便学习

前段时间，我们为广州中山大学环境学院的客户的仪器做的标样的分析数据，参看上图。实践证明，ZS173 DLS具有极高的灵敏度和测试准确性，完全胜任在线与FFF或GPC/SEC直接联用的工作，数据精度几近完美：测试结果，在标样的纳米尺寸的误差范围内，可以说是没有偏差！

由于在线联用，使得样品被稀释，因此，对DLS的灵敏度提出了更高要求。而现有的几乎所有的90度角取光的DLS仪器，在线直接联用，灵敏度都下降很多。所以，马尔文的 S173/ZS173/ZSP 系列，几乎是唯一适用于在线与FFF或GPC/SEC直接联用的DLS仪器。其取光角度173度，相当于反过来的7度小角。从原理上讲，7度小角，对大尺寸更灵敏；而173度，则对小尺寸更灵敏。

关于静态多角激光散射检测器MALS的标定的问题，还是个挺复杂的事儿。目前，我知道的情况是，大部分厂家的激光散射检测器LS，都是需要标定的，只有个别厂家的MALS不需要标定。这里面，有激光散射原理上的问题，经典的激光散射检测器，是应该测瑞利比的，但是这样的话，就需要激光散射的光源有比较大的光强；但是当激光散射不是脱机使用、而是在线使用，与SEC或FFF联用时，样品浓度将在这些HPLC类仪器里被进一步稀释，所以，对激光散射检测器的灵敏度，也就是信噪比，提出了较大挑战。而增大激光散射检测器的光源的光强，恰恰降低了信噪比：虽然信号更强了，但是噪音却也更大更大了，反而使信噪比下降了！所以，为了提高在线检测的信噪比、灵敏度，大部分厂家的LS检测器，都选择50毫瓦（50mW）的激光光源，但是这样的光强、功率，就很难测瑞利比了，所以，就需要经常标定。这也算是有一得也有一失吧。索性，不论是SEC/GPC，还是FFF仪器，都需要经常通过标定来检验一下仪器是否状态良好，所以，也就“搂草打兔子——捎带手”地做一下LS的标定了。

另外，那个“个别厂家”的所谓激光散射检测器的标定，实际上也是一个非常复杂的工程过程，是对各个角度的校准，实际应用中客户自己是无法做到的。而从纯技术的角度来说，其实这也说明了，18角光散射检测器在光路设计上是有问题的、不够严谨，呵呵，设计思想和原理，已经落后了——毕竟是上个世纪80年代的产品，因为有不止一个厂家的LS产品，都已经采用三维立体取光的技术了，使得光路设计既合理又简单，根本无需逐一角度地标定、校准！

当然，这个所谓需要经常标定，并不是每一次做实验之前都标定，呵呵，而是一小段时间内，应该标定一次，例如：SEC/FFF仪器使用频繁的时候，最好每周标定一次；不频繁的时候，三个月、半年甚至一年标定一次也是可以的。有的厂家说他们的18角MALS大段时间不用标定、甚至永远不用标定，这个就不靠谱了。有时候，即使不换溶剂，仪器的样品池也可能脏了，测试就不准确了。如果不用标样标定一下，是无法知道脏不脏的啊！

与SEC/GPC或FFF在线直接联用的激光散射检测器，从设计原理与制造角度来说，都无法与脱机的、大型的激光散射仪相媲美的，只能算是一个简化的激光散射仪，这也是因为在线使用的特殊要求所限制的。因此，单纯地、片面地追求在线的激光散射检测器在散射原理上的经典性，其实是会影响在线使用的效果的！就如上面我们所说的那样。

脱机使用的大型的激光散射仪，其光源的光强、波长，可调节的范围很宽；同时，散射取光的角度，最小从5度、最大到几乎是180度这么一个很宽的范围，而且几乎都是每一度、甚至每半度就可调节一下！这些特点，都是在线激光散射检测器无论如何也做不到的。

我们的竞争对手，总是吹嘘自己的多角光散射检测器如何如何经典，不用标定之类的，其实，不仅仅毫无意义，而且很不实用：用甲苯标定又能咋样啊？现在，不少实验室对安全很重视，反倒是甲苯这种易燃易爆、同时还是药物依赖性化学品的试剂，很难搞到，使用也受限制，还不如用聚合物标样标定呢，又安全又不涉及成瘾性化学品的问题。

我在本社区的凝胶渗透色谱论坛上还看到一个帖子，说是浓度型检测器有信号、有色谱峰，但是激光散射检测器没有色谱峰，这是什么原因。我们的竞争对手的人，回答说：激光散射检测器没信号，可能是什么dn/dc值太小啦、溶剂峰啦之类的，呵呵。都没说到点子上啊！

激光散射检测器的信号，由两部分组成：一个是样品组分的浓度，另一个是样品组分的分子量。如果样品组分，不论是待测高分子样品，还是溶剂峰，如果只有浓度型检测器的信号，如：示差、紫外等等，而没有激光散射检测器的信号，就说明，这个组分里，没有高分子材料组分！这就是我们常说的，激光散射检测器和四毛细管特性粘度检测器具有选择性，只对有一定分子量、有一定特性粘度的样品组分有响应，同时也是利用这个性质来监控分离过程。

激光散射检测器的信号，跟dn/dc值无关！dn/dc值，只与示差折光检测器信号有关，并进一步与计算绝对分子量有关。例如下图：

上图中，第一个组分峰是蛋白质，其紫外信号很强，但是90度角的静态激光散射的信号却很低，说明其分子量很小；第二个组分峰，是病毒，其紫外信号不大，但是还能看到，但是其90度静态激光散射的信号却很强、很大，说明其分子量很大很大，同时，右侧纵坐标的DLS测试出来的Rh数据显示，病毒组分的最后出来的部分，其尺寸，也就是Rh，达到了超过300nm啊，这个尺寸下，其分子量估计要上亿了啊！因为蛋白质或病毒这类样品，都是很高的分子密度的，顺便说一句，也因此，其特性粘度很小，所以通常也就没人去研究蛋白质和病毒的特性粘度了。

最后，从出峰顺序：先出小的，后出大的，可以看出，这个色谱图，是用场流仪做的，不是SEC/GPC，但是激光散射检测器与浓度型检测器的原理都是一样的。

这个图很典型，不仅仅有浓度型检测器有信号、而激光散射检测器没信号，还有反过来的情况：浓度型检测器信号很小，但是激光散射检测器信号很大，希望大家通过这个应用，能够对激光散射检测器，不论静态还是动态，都能有更准确、更深刻的理解。

这也说明，凝胶色谱论坛，水平堪忧啊，不过，也不关我们的事儿，咱也管不了，我们只要管好我们自己这一亩三分地儿就 ok 了，反正在我们这个论坛，绝对会是对广大用户朋友负责任的。

有几次，看到有些客户招标买激光散射检测器MALS而发出来的技术指标，里面有些内容显得挺可笑的，呵呵，在这儿也跟大家聊聊：在MALS的技术指标中，样品池死体积是一个比较重要的指标，对于在线检测器，样品池死体积，还是越小越好，这样，样品经过GPC/SEC柱子分离、或者FFF分离之后，就可以进入较小的样品池，从而避免发生混流现象；反之，如果样品池死体积较大，那么样品在柱子上或FFF分离通道盒内已经完成了分离了，却又进入了体积比较大的样品池而不能马上离开该样品池的话，就会造成混流现象，从而影响到示差折光检测器RI测定样品分子量分布数据的准确性——样品在样品池内留存的时间延长、分子量分布将变宽！而通常情况下，RI检测器是不能承受反压的，因此，要么RI被置于MALS的后面，要么与MALS并联，尤其是再增加了四毛细管粘度检测器的时候，就必须并联了！

而我们的主要竞争对手，就在样品池死体积这个指标上动了不少歪脑筋，其18角MALS，呈平面展开在管状样品池周围——样品流动方向与散射取光的18个角度，在同一平面内，因为散射取光角度比较多，光路复杂，所以，实际上样品池就小不下来的！可是，许多次，我都看到，技术指标上写着：样品池死体积是纳升级的数据，呵呵。我们来算一算：1立方米等于1000升，那么一升就是1立方分米，进而，1升/立方分米就等于1000毫升/立方厘米，也就是1毫升是1立方厘米，1微升是1立方毫米，1纳升是1立方微米。POSTNOVA公司的9个角度和21个角度的MALS，样品池死体积是63微升，也就是63立方毫米，还是肉眼可见的体积。而其外观，是一个透明的、圆柱状的石英玻璃块，高度不到10厘米，直径也差不多这么大尺寸。63微升，已经是很小的体积了啊；如果是纳升级的体积，已经是肉眼看不见的了啊！这么微小的体积，维护保养、清洗，都很困难啊，还很容易压力增大，所以没有实用价值的啊，显然是胡说。呵呵，而实际上，W的18角，样品池是管状的，是非常宏观的，即使内径很细，也几乎不可能到纳升级，特别是相对于比较粗大的光电二极管，就更不可能那么小了。

反过来说，如果真是纳升级的，那么宏观可见的管状样品池外观，内径却很细，那么说明样品池的管壁很厚，而该MALS又是18个角度平面散开来布置，那么激光穿过很厚的管壁，会发生不均匀的折射，从而严重影响激光散射的测试数据。而POSTNOVA和美国布鲁克海文、英国马尔文，都是采用三维立体取光，样品流动方向与散射取光角度呈垂直，而不是在一个平面上，各个取光角度相对于样品池的石英玻璃的壁，都是垂直的，不存在折射现象。尽管W在其MALS出厂时，对折射进行了校准补偿，但是仍然无法完全弥补其散射取光原理的缺陷带来的性能上的问题，特别是德国POSTNOVA公司的技术工程师们一直对W的这个平面取光设计持否定态度。而布鲁克海文、马尔文，则更是激光散射技术领域里的领先者了，他们的脱机的大型光散射仪、动态激光粒度仪DLS，技术性能上不知道要甩开W多少条街了啊，呵呵。

实际上，据我所知，纳升这个数据，是18角光散射检测器的散射体积！这个数据，与激光散射的原理有关，是一个光学数据，且越大越好，而与样品池死体积这一简单的物理体积没有任何关系。所以，是竞争对手坏了良心、糊弄客户和其它对手。其它所有MALS或LALS厂家的产品，也都有纳升级的散射体积这个数据的，只不过一般的产品手册上不会写这么详细的指标，都是在仪器操作手册/技术手册上可能会有的。

以前，viscotek销售团队，总是攻击W 的18角MALS样品池死体积大，大约是72微升；而viscotek的是18微升，现在归了安捷伦了的美国PDI的15度 90度角的激光散射检测器，是12微升。我估计是为了跟其它厂家竞争，W才把散射体积的纳升级的数据当做样品池死体积来糊弄客户的。

总之，一句话，平面取光的MALS，样品池死体积，是不可能比三维立体取光的MALS/LALS的样品池死体积更小的！

我说这么多的意思，就是希望广大用户在买仪器的时候，要仔细一点儿，稍微动动脑子，就可以用常识来判别有些厂家的谎言。W的差劲儿事儿还有不少呢，2017年跳河省大学采购AF4 MALS，技术指标里又有一个笑话：紫外检测器的灵敏度，竟然比其噪音还低，呵呵，一看就是在瞎编。浓度型检测器，基线不是完全平坦的直线，而是有起伏的，这个起伏，就是噪音；灵敏度，是指检测器能检测到的有意义的最低信号，一般是默认信号强度高于噪音2~3倍，并且还有一定宽度，就可以认定为样品组分了（我跟我们技术服务工程师详细确认了这点）。所以，灵敏度要高于噪音值才是正确的。反过来说，如果灵敏度比噪音低，那么就是噪音大于灵敏度了，也就是噪音覆盖了灵敏度，那还怎么能检测到信号呢，全是噪音了啊，哈哈哈哈，唉，W编瞎话都不动脑子啊，真是丢人啊。

为方便使用在线DLS的客户，我们可提供聚苯乙烯微球纳米标样，尺寸有：20nm、60nm、100nm、125nm、200nm、350nm、600nm和900nm，共8种不同尺寸的标物，均是美国国家标准局NIST可溯源的；还提供硅纳米微米颗粒标物，尺寸有：10nm、50nm、100nm、300nm、600nm、800nm、1um，共7种。这些标样标物，即可以做标准曲线，用于纳米尺寸的标定，也可用于对DLS检测器进行标定、校验，以确保测试数据准确。通常是10~15ml的瓶装的水分散的，浓度从1%到5%不等，瓶上均有介绍。

在我们上传到本论坛的介绍多角激光散射检测器的视频中，提到两个问题，我在这里给大家介绍一下：
1 关于散射光的折射校正，或称：折射标定：在视频中，提到POSTNOVA的多角激光散射检测器采用了立体取光的原理，无需折射校正、折射标定。这是针对我们的竞争对手的多角度激光散射检测器的技术路线而言的，其采用了平面布置的、管状的激光散射检测器样品池，在样品池周边布置了10多个角度光电二极管等光信号收集硬件，这种结构的缺点，就是除了90度角以外，其余角度上，光信号收集硬件，如：光电二极管，与样品池外壳玻璃存在夹角，散射光在这些角度上，会产生折射——光线两次经过：样品溶液与玻璃管的界面、玻璃管与外面设备的界面，都发生折射，需要对光强进行校正、标定。在更换流动相时、以及长期使用后，都需要进性折射校正。在其英文操作手册中，有详细介绍。

但是，由于这一操作过程难度大、繁琐，我们觉得，国内用户，貌似没人真正这样操作过，甚至，大部分的他们的用户都不知道有这么个事儿呢，呵呵。可见，对手的仪器哪能做出准确的数据呢，而且还叫嚣着从不用标样标定，那么，照此，用户连自己做的数据对不对都不知道啊。那些替 W 忽悠从不用标样标定的人，都是在胡说八道、自取其辱。现在，不懂装懂的假行家特别多，尤其在一些名牌大学里。