主题:【原创】【科普】SCX:磺酸基阳离子交换色谱柱的使用及维护——盐酸二甲双胍分析例合辑

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SCX:磺酸基阳离子交换色谱柱的使用及维护

——盐酸二甲双胍分析例合辑


相信大家在使用离子交换模式或离子交换色谱柱时,难免会遇到一些问题,YoYo一直想给大家分享一些特殊色谱柱的使用注意事项及维护方法的干货帖,正巧最近好多客户纷纷反馈了使用大曹三耀CAPCELL PAK SCX色谱柱对盐酸二甲双胍进行分析得到的良好数据,也许能帮助到大家~

所以今天YoYo将以盐酸二甲双胍为分析例,阐释CAPCELL PAK SCX色谱柱的使用及维护方法~
本篇干货数据的阅读时间大约需要10min~准备好了吗~Let's go~



Metformin

二甲双胍


上图为2015年版《中国药典》盐酸二甲双胍的有关物质分析方法,黄色部分是关键点:
1、使用磺酸基阳离子交换色谱柱,即SCX色谱柱
2、二甲双胍和三聚氰胺分离度应大于10.0
3、记录色谱图至二甲双胍峰保留时间的2倍

【常规分析】


要求:
常规条件下,保持良好分离
使用CAPCELL PAK SCX UG80 S5; 4.6 mm i.d. × 150 mm色谱柱,严格按照中国药典方法进行分析,盐酸二甲双胍与三聚氰胺分离度为21.62,远远超过药典分离度大于10的要求,双氰胺也得到充分保留,与溶剂峰基本分离。



系统适用性图谱

*峰1:三聚氰胺,峰2:二甲双胍,峰3:双氰胺


色谱柱 :CAPCELL PAK SCX UG80 S5; 4.6mm i.d. × 150 mm
流动相 :1.7% 磷酸二氢铵(磷酸调节pH3.0)
流 速 :1.0 mL/min
柱 温 :35 °C
波 长 :218 nm
样 品 :盐酸二甲双胍 5 μg/mL  三聚氰胺2 μg/mL
进样量 :10 μL


使用150mm柱长的SCX色谱柱,在保证分离的前提下,二甲双胍主峰保留时间又不至过长,较250mm的常规柱型来说分析效率更高





【快速分析】
要求:
快速分析+良好分离
若想进一步缩短分析时间,可以在不改变方法的前提下,使用柱长更短的4.6 mm i.d. × 100 mm规格SCX色谱柱进行分析,如下图,二甲双胍峰保留时间19.34min,峰底宽约3分钟,拖尾因子为1.04与三聚氰胺之间分离度为18.5,同样满足药典要求!

系统适用性图谱


双氰胺图谱


敲黑板!使用100mm柱长进行分析,每针分析时间仅需40min,和150mm柱长结果相比,分析效率又有了显著提升~


【杂质分析】
要求:
各杂质间取得良好分离
如果样品中要求分离的杂质较多,也可以选用长柱,即CAPCELL PAK SCX UG80 S5;4.6 mm i.d. × 250 mm进行分析。为缩短分析时间,可将流动相盐浓度调整为20mmol/L,pH调至2.8,在此条件下,二甲双胍保留时间为18.183min,且与三聚氰胺及其杂质E、C、B间亦取得了良好分离结果。


二甲双胍与相关杂质的分离



使用250mm柱长的SCX色谱柱,通过调整分析条件,也可实现杂质的良好分离,同时兼顾保留时间不至过长。


【溶出分析】
要求:
缩短分析时间,提高工作效率

如果您做溶出,为提高工作效率,还可以进一步缩短柱长——使用4.6 mm i.d. × 50 mm规格的SCX色谱柱,做二甲双胍的溶出度分析,浓度0.25 mg/mL,进样5μL,理论塔板数为3200-3300,既满足要求,工作效率也提高了。

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至此,我们将基于药典方法对盐酸二甲双胍分析的几种情况及其对应的色谱柱规格做了总结,感谢相关客户提供的良好反馈结果~YoYo认为很具有参考意义,不知道有没有帮助到大家呢~

接下来,YoYo想对于使用SCX色谱柱进行分析时的常见问题及对应解决方案进行介绍,仍然结合盐酸二甲双胍分析中出现的问题进行说明,希望可以帮助大家解决以下可能遇到的问题:
基线下降、不稳
峰形不佳、柱效下降
杂质分离度不佳


1. 基线问题——平衡



基线不平、下降、漂移等现象通常是由于色谱柱平衡不充分造成的。
CAPCELL PAK SCX是键合磺酸基的强阳离子交换色谱柱,在离子交换模式下,需要对色谱柱进行长时间的充分平衡。
下图为平衡不充分导致基线下沉的例子,可以看到,在经过30h的充分平衡后,可以得到良好稳定的基线。

充分平衡前后的基线对比



经过30h的平衡,基线良好,二甲双胍峰形正常


-关于SCX柱流动相置换-



由于SCX为强阳离子交换色谱柱,故所需平衡时间较长,同时,出厂封存液为100%乙腈,而盐酸二甲双胍药典方法流动相条件为盐溶液,因此,为避免盐析,流动相的置换就显得尤为重要。

-SCX色谱柱保存液置换流程-

①20%乙腈水溶液——冲洗0.5h
②低浓度盐溶液(流动相稀释10倍)——冲洗1h
(*10倍柱体积≈42mL≈42min)
③流动相——过夜平衡


-SCX柱保存-

①短期保存:流动相封存(酸性盐溶液)
②长期保存:冲洗-置换为100%乙腈
*注意:堵头一定要拧紧,常温保存。


2. 色谱峰峰形异常——冲洗


在实际样品分析中,色谱柱在经过一段时间的使用后,可能会出现峰形变差的现象,通常是样品基质或杂质在色谱柱中蓄积或盐析带来的影响。



峰形变差(客户反馈)


上图为客户反馈的峰形变差色谱柱,将该柱寄回实验室,进行柱效测定的结果如下图,峰形变差,理论塔板数降低明显。



柱效测定结果



柱头颜色发暗,有白色结晶,怀疑为盐析


-解决方案-

通过低盐溶液的长时间冲洗,峰形及理论塔板数均能得到明显改善。



经过冲洗后得到恢复的柱效测定结果


-如何避免盐析-

①注意色谱柱及液相系统的保存液与流动相之间的溶解性及置换
②连续几天分析时,过夜时,可对色谱柱进行小流速通液操作


3. 杂质分离度不佳——调整方法


-杂质B和C的分离-



客户关注杂质B和C的分离情况,如下图,杂质B和杂质C在14min左右出峰,两杂质峰完全重合。



杂质B、C峰完全重合


色谱柱 :CAPCELL PAK SCX UG80 S5; 4.6 mm i.d. × 150 mm

流动相 :4% 磷酸二氢铵(pH 3.0)

流 速 :1.0 mL/min

柱 温 :35 °C

波 长 :218 nm

样 品 :客户提供系统适用性样品

进样量 :20 μL


-解决方案-

调整流动相pH可有效改善杂质B和C的分离度。如下图,pH为2.8时,杂质B和C之间分离度为1.80,满足要求。


调节pH对杂质B、C分离度的影响


-主峰与杂质E的分离-

如下图,客户使用250mm柱长的SCX色谱柱进行分析,二甲双胍主峰与杂质E的分离效果不理想。



系统适用性图谱-二甲双胍与杂质E分离不理想



色谱柱 :CAPCELL PAK SCX UG80 S5; 4.6mm i.d. × 250 mm

流动相 :1.7% 磷酸二氢铵(磷酸调节pH3.0)

流 速 :1.0 mL/min

柱 温 :25 °C

波 长 :218 nm

样 品 :客户制备提供

进样量 :10 μL


-解决方案-

降低pH可有效改善杂质E与二甲双胍之间的分离度。



系统适用性图谱-调节pH对分离度的影响


*SCX色谱柱的pH使用范围为2-7,在pH2.0条件下可以稳定使用。


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以上就是使用SCX色谱柱分析例及使用注意事项的汇总,以盐酸二甲双胍这一典型项目为分析例进行了详细说明。
接下来,对于二甲双胍这个项目,还有个发散出来的分支数据——不使用SCX色谱柱,也可以分析吗?
感兴趣就往下翻吧~

使用离子交换色谱柱分析,平衡时间太长,如果不拘泥于药典方法,也可以选择CAPCELL PAK大家族里的另一款奇葩——键合立体笼状结构の金刚烷基色谱柱——CAPCELL PAK ADME,也能得到良好分离与保留~



系统适用性图谱-ADME色谱柱

*峰上标数字由下至上依次为理论塔板数、分离度与不对称因子

色谱柱 :CAPCELL PAK ADME S5; 4.6mm i.d. × 250 mm

流动相 :20mmol/L 磷酸二氢钠水溶液

流 速 :1.0 mL/min

柱 温 :35 °C

波 长 :225 nm

样 品 :双氰胺、三聚氰胺和二甲双胍浓度均为0.01mg/ml(50%甲醇溶解,流动相稀释)

进样量 :5 μL


使用ADME色谱柱进行分析,平衡时间较短,且能保证良好保留与分离~是不是很优秀~

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CAPCELL PAK SCX介绍+说明书

http://www.sanyofine.com.cn/product/hplc/inverting/cartridges/2017/0703/130.html

CAPCELL PAK ADME介绍+说明书



http://www.sanyofine.com.cn/product/hplc/lizijiaohuanzhu/2017/0703/144.html
二甲双胍等双胍类化合物的分析(二甲双胍、丁双胍和苯乙双胍)
http://bbs.instrument.com.cn/topic/6289670
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2018/5/10 10:18:14 Last edit by capcellpak
Insm_f79fddc5
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老师,药典规定的供试品浓度为5mg/ml,用这根柱子不会拖尾么?