主题:【第十一届原创】一次性使用卫生用品卫生标准产品微生物的检测

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一次性使用卫生用品卫生标准产品微生物的检测

GB 15979-2002(附录B)

西安国联质量检测技术股份有限公司

化工室:张苗苗


一、方法概述
1.1 细菌菌落总数与初始污染菌检测:将处理的检样自然沉降后取上清液作菌落计数。共接种5个平1.2 大肠菌群检测:将处理的检样取样液5mL,接种50mL乳糖胆盐发酵管,置35℃±2℃培养24h后,如不皿,每个平皿中加入1mL样液,用融化的营养琼脂倒入每个平皿内混匀,待琼脂凝固后翻转平皿置35℃±2℃培养48h后,计算平板上的菌落数。
产酸产气,则报告为大肠菌群阴性。如产酸产气,则接种伊红美蓝平板,如有典型大肠菌落,进行鉴定。
1.3 绿脓杆菌检测:将处理的检样取样液5mL,接种50mLSCDLP培养液中,充分混匀,置35℃±2℃培养18~24h,如有绿脓杆菌生长,培养液表面呈现薄菌膜,培养液呈现黄绿色或蓝绿色。从培养液的薄膜处挑取培养物,划线接种十六烷三甲基溴化铵琼脂平板,置35℃±2℃培养18~24h,观察菌落特征,如有特征菌落,进行鉴定。
1.4 金黄色葡萄球菌检测:将处理的检样取样液5mL,接种50mLSCDLP培养液中,充分混匀,置35℃±2℃培养18~24h,自上述培养中取1~2接种环,划线接种置血琼脂培养基上,置35℃±2℃培养18~24h,观察菌落特征,如有特征菌落,进行鉴定。
1.5 溶血性链球菌检测:将处理的检样取样液5mL,接种50mL葡萄糖肉汤,置35℃±2℃培养18~24h,将培养物划线接种置血琼脂平板,35℃±2℃培养24h,观察菌落特征,如有特征菌落,进行鉴定。
1.6 真菌菌落总数检测:将处理的检样自然沉降后取上清液作真菌菌落计数。共接种5个平皿,每个平皿中加入1mL样液,用沙氏琼脂培养基倒入每个平皿内混合均匀,琼脂凝固后翻转平皿置25℃±2℃培养7d后,分别于3﹑5﹑7天观察,计算平板上的菌落数,如有发现菌落蔓延,以前一次的菌落计数为准。
1.7 真菌定性检测:将处理的检样取样液5mL,接种50mL沙氏培养基中,25℃±2℃培养7天,逐日观察有无真菌生长。培养管浑浊应转钟沙氏琼脂培养基。
二、仪器与试剂
2.1 细菌菌落总数与初始污染菌检测
仪器:电子天平、恒温水浴锅、电热恒温培养箱、无菌平皿、无菌吸量管、剪刀、无菌均质袋
试剂:生理盐水(浓度为0.85%)、营养琼脂培养基
2.2 大肠菌群检测
仪器:电子天平、恒温水浴锅、无菌吸量管、剪刀、无菌均质袋、乳糖胆盐发酵管、电热恒温培养箱、生化培养箱、显微镜、生物安全柜
试剂:生理盐水(浓度为0.85%)、乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝平板、革兰氏染液
2.3绿脓杆菌检测:
仪器:电子天平、恒温水浴锅、无菌吸量管、剪刀、无菌均质袋、电热恒温培养箱、生化培养箱、显微镜、生物安全柜
试剂:生理盐水(浓度为0.85%)、SCDLP培养基、十六烷基三甲基溴化铵平板、革兰氏染液、氧化酶纸片、绿脓菌素培养基、三氯甲烷、盐酸、硝酸盐蛋白胨水培养基、明胶培养基、营养琼脂斜面
2.4金黄色葡萄球菌检测:
仪器:电子天平、恒温水浴锅、无菌吸量管、剪刀、无菌均质袋、电热恒温培养箱、生化培养箱、显微镜、生物安全柜
试剂:生理盐水(浓度为0.85%)、SCDLP培养基、血平板、革兰氏染液
、甘露醇培养液、兔血浆
2.5溶血性链球菌检测:
仪器:电子天平、恒温水浴锅、无菌吸量管、剪刀、无菌均质袋、电热恒温培养箱、生化培养箱、显微镜、生物安全柜
试剂:生理盐水(浓度为0.85%)、葡萄糖肉汤、血平板、革兰氏染液
、草酸钾血浆、氯化钙、每片含0.04单位杆菌肽的纸片
2.6 真菌菌落总数检测:
仪器:电子天平、恒温水浴锅、无菌平皿、无菌吸量管、剪刀、无菌均质袋、霉菌培养箱
试剂:生理盐水(浓度为0.85%)、沙氏培琼脂养基
2.7 真菌定性检测:
仪器:电子天平、恒温水浴锅、无菌平皿、无菌吸量管、剪刀、无菌均质袋、霉菌培养箱
试剂:生理盐水(浓度为0.85%)、沙氏脂养基、沙氏培琼脂养基
三、样品的采集与保存
与同一批号的三个运输包装中至少抽取12个最小销售包装样品,1/4样品用于检测,1/4样品用于留样,另1/2样品(可就地封存)必要时用于复检。抽样的最小销售包装不应有破裂,检验前不得启开。
四﹑ 分析步骤
样品制备:在100级净化条件下用无菌方法打开用于检测的至少3个包装,从每个包装中取样,准确称取10g±1g样品。剪碎后加入到200mL灭菌生理盐水中,充分混匀,得到一个生理盐水样液。
4.1细菌菌落总数与初始污染菌检测
样品对照组:上述生理盐水样液自然沉降后取上清液。
试验组:取上述生理盐水样液自然沉降后取上清液9mL,加入1mL含有小于1000cfu/mL含有菌落的制样。
菌液组:制备100cfu/mL菌液。
各组共接种5个平皿,每个平皿中加入1mL样液,然后用冷却至45℃左右的熔化的营养琼脂培养基15~20mL倒入每个平皿内混合均匀。待琼脂凝固后翻转平皿置36℃培养48h,计算平板上的菌落数。
4.2大肠菌群检测
样品对照组:取样液5mL
试验组:取样液5mL接入大肠杆菌菌株
菌液组:加入大肠杆菌菌株
各试验组接种50mL乳糖胆盐发酵管,置36℃培养24h,如不产酸也不产气,则报告为大肠菌群阴性。
如产酸产气,则划线接种伊红美蓝平板,置36℃培养24h,观察平板上菌落形态。典型的大肠菌落为黑紫色或红紫色,圆形,边缘整齐,表面光滑湿润,常具有金属光泽,也有的呈紫黑色,不带或略带金属光泽,或粉红色,中心较深的菌落。
取疑似菌落1~2个作革兰氏镜检,同时接种乳糖发酵管,置36℃培养24h,观察产气情况。
4.3绿脓杆菌检测
样品对照组:取样液5mL
试验组:取样液5mL接入绿脓杆菌菌株
菌液组:加入绿脓杆菌菌株
加入到50mLSCDLP培养液中,充分混匀,置36℃培养18~24h。如有绿脓杆菌生长,培养液表面呈现一层薄菌膜,培养液长呈现黄绿色或者蓝绿色。从培养液的薄膜处挑取培养物,划线接种至十六烷三甲基溴化铵琼脂平板,36℃培养18~24h,观察菌落特征。绿脓杆菌在此培养基上生长良好,菌落扁平,边缘不整,菌落周围培养基略带粉红色,其他菌不长。
取可疑菌落涂片作革兰氏染色,镜检为革兰氏阴性者应进行下列试验:
氧化酶试验:30S内出现粉红色或紫红色,为氧化酶试验阳性,不变色为阴性。
绿脓菌素试验:取可疑菌落,分别接种在绿脓菌素测定培养基斜面,36℃培养24h,加入三氯甲烷3~5mL,充分振荡使培养物中可能存在的绿脓菌素溶解,待三氯甲烷呈蓝色时,用吸管移到另一试管中并加入1mol/L的盐酸1mL,振荡后静置片刻。如上层出现粉红色即为阳性,表示有绿脓杆菌存在。
硝酸盐还原产气试验:挑取被检菌落纯培养物接种在硝酸盐蛋白胨水中,置36℃培养24h,培养基小倒管中有气者即为阳性。
明胶液化试验:取可疑菌落纯培养物,穿刺接种在明胶培养基内,置36℃培养24h,取出放与4~10℃,如仍呈现液态为阳性,凝固者为阴性。
42℃生长试验:取可疑培养物,接种在普通琼脂斜面上,置42℃培养24~48h,有绿脓杆菌生长为阳性。
4.4金黄色葡萄球菌检测
样品对照组:取样液5mL
试验组:取样液5mL接入金黄色葡萄球菌菌株
菌液组:加入金黄色葡萄球菌菌株
加入到50mLSCDLP培养液中,充分混匀,置36℃培养24h。
取上述增菌液中1~2环,划线接种在血琼脂培养基上,置36℃培养24~48h。在血平板上该菌菌落呈金黄色,大而凸起,不透明,表面光滑,周围有溶血圈。
挑取典型菌落,涂片作革兰氏染色镜检, 金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌,排列成葡萄状,无芽孢与荚膜。镜检符合上述情况,应进行下列试验:
甘露醇发酵试验:取上述菌落接种甘露醇培养液,置36℃培养24h,发酵甘露醇产酸者为阳性。
血浆凝固酶试验:玻片法:取清洁干燥载玻片,一端滴加一滴生理盐水,另一端滴加一滴兔血浆,挑取菌落分别于生理盐水和血浆混合,5min如出现团状或颗粒状凝块,而盐水滴仍均匀混浊无凝固则为阳性,如两者均无凝固则为阴性。凡盐水滴和血浆均有凝固现象,在进行试管凝固酶试验;试管法:吸取1:4新鲜血浆0.5mL,放灭菌小试管中,加入等量待检菌24h肉汤培养物0.5mL。混匀,放36℃温箱,每半小时观察一次,24h之内呈现凝块即为阳性。同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌株肉汤培养物各0.5mL作为阳性和阴性对照。
4.5溶血性链球菌检测
样品对照组:取样液5mL
试验组:取样液5mL接入溶血性链球菌菌株
菌液组:加入溶血性链球菌菌株
加入到50mL葡萄糖肉汤,36℃培养24h。
将培养物划线接种血琼脂平板,36℃培养24h观察菌落特征。溶血性链球菌在平板上为灰白色,半透明或不透明,针尖状突起,表面光滑,边缘整齐,周围有无透明溶血圈。
挑取典型菌落作涂片革兰氏染色镜检,应为革兰氏阳性,呈链状排列的球菌。镜检符合上述情况,应进行下列试验:
链激酶试验:吸取草酸钾血浆0.2mL,加入0.8mL灭菌生理盐水,混合后再加入待检菌24h肉汤培养物0.5mL和0.25%氯化钙0.25mL,混匀,放36℃水浴中,2min观察一次,待血浆凝固后继续观察并记录溶化时间。如2h内不熔化,继续放置24h观察,如凝块全部熔化为阳性,24h仍不熔化为阴性。
杆菌肽敏感试验:将被检菌菌落涂于血平板上,用灭菌镊子取每片含0.04单位杆菌肽的纸片放在平板上,同时以已知阳性菌株作对照,在36℃放置18~24,有抑菌带者为阳性。
4.6真菌菌落总数检测
样品对照组:上述生理盐水样液自然沉降后取上清液。
试验组:取上述生理盐水样液自然沉降后取上清液9mL,加入1mL含有小于1000cfu/mL含有白色念珠菌菌落的制样
菌液组:制备100cfu/mL白色念珠菌菌液
各组检样共接种5个平皿,每个平皿中加入1mL样液,然后用冷却至45℃左右的熔化的沙氏琼脂培养基15~20mL倒入每个平皿内混合均匀。待琼脂凝固后翻转平皿置27℃培养7天,分别于3、5、7天观察,计算平板上的菌落数,如发现菌落蔓延,以前一次的菌落计数为准。
4.7真菌定性检测
样品对照组:取样液5mL
试验组:取样液5mL接入白色念珠菌菌株
菌液组:加入白色念珠菌菌株
加入到50mL沙氏培养基中,27℃培养7天,逐日观察有无真菌生长。培养管混浊应转钟沙氏琼脂培养基,证实有真菌生长。
五、试验结果
5.1细菌菌落总数和初始污染菌

菌落数cfu/g

样品对照组

试验组

菌液组

1

<20

98

96

2

<20

96

95

3

<20

99

97

4

<20

96

98

5

<20

97

94


5.2大肠菌群

试验项

样品对照组

试验组

菌液组

乳糖胆盐发酵管产酸产气

产酸产气

产酸产气

伊红美蓝平板有无典型菌落

/

革兰氏染色镜检

/

革兰氏阴性无芽孢杆菌

革兰氏阴性无芽孢杆菌

乳糖胆盐发酵管复发酵产酸产气

/

产酸产气

产酸产气


5.3绿脓杆菌

试验项

样品对照组

试验组

菌液组

培养液有无呈现薄菌膜

十六烷基三甲基溴化铵琼脂平板有无典型菌落

/

革兰氏染色镜检

/

革兰氏阴性菌

革兰氏阴性菌

氧化酶试验

/

阳性

阳性

绿脓菌素试验

/

阳性

阳性

硝酸盐还原产气试验

/

阳性

阳性

明胶液化试验

/

阳性

阳性

42℃生长试验

/

阳性

阳性



5.4金黄色葡萄球菌

试验项

样品对照组

试验组

菌液组

血平板有无典型菌落

革兰氏染色镜检

/

革兰氏阳性球菌,葡萄状,无芽孢与荚膜

革兰氏阳性球菌,葡萄状,无芽孢与荚膜

甘露醇发酵试验

/

阳性

阳性

血浆凝固酶试验

阴性

阳性

阳性



5.5溶血性链球菌

试验项

样品对照组

试验组

菌液组

血平板有无典型菌落

革兰氏染色镜检

/

革兰式阳性,呈链状排列的球菌

革兰式阳性,呈链状排列的球菌

链激酶试验

/

阳性

阳性

杆菌肽敏感试验

/

阳性

阳性



5.6真菌菌落总数

菌落数cfu/g

样品对照组

试验组

菌液组

1

<20

102

103

2

<20

96

105

3

<20

99

100

4

<20

101

104

5

<20

102

99



5.7真菌定性

试验项

样品对照组

试验组

菌液组

沙氏培养液有无混浊

沙氏琼脂培养基有无真菌生长



六、方法准确性
6.1细菌菌落总数
回收率=试验组/菌液组*100
=(98+96+99+96+97)/(96+95+97+98+94)*100
=486/480*100=101.25
回收率为101.25大于70%,所做试验符合要求。
6.2大肠菌群
样品对照组未检出,试验组与菌液组均检出大肠菌群,符合要求。
6.3绿脓杆菌
样品对照组未检出,试验组与菌液组均检出绿脓杆菌,符合要求。
6.4金黄色葡萄球菌
样品对照组未检出,试验组与菌液组均检出金黄色葡萄球菌,符合要求。
6.5溶血性链球菌
样品对照组未检出,试验组与菌液组均检出溶血性链球菌,符合要求。
6.6真菌菌落总数
回收率=试验组/菌液组*100
      =(102+96+99+101+102)/(103+105+100+104+99)*100
      =500/511=97.85
回收率为97.85大于70%,所做试验符合要求。
6.7真菌定性
样品对照组未检出,试验组与菌液组均检出真菌,符合要求。
九、总结
      通过对整体确认,本次验证结果符合GB 15979-2002中的要求,因此用该标准方法测定一次性使用卫生用品中细菌菌落总数、大肠菌群、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、真菌菌落总数、真菌定性的结果是准确的,可靠的。
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