主题：【第十一届原创】植物性食品中农药多残留的测定(扩项报告)

1  安全提示
本实验中所用到的有机溶剂（乙腈、丙酮、正己烷、甲苯）均为有毒物质，应在通风橱内进行操作。
2  方法提要
本标准操作程序是本实验室参照有关文献标准的样品前处理方法及测定方法，进行验证后，将某些关键步骤进行细化。
本标准操作程序验证的样品为白菜、苹果、百香果，适用于普通植物性食品，但不适用于生姜、蒜头等辛辣味蔬菜。茶叶样品按GB/T23204-2008进行操作。
3  原理
样品中农药经乙腈均质后，盐析除水，植物性食品用Envi-18和Carb/PSA柱净化，丙酮+正己烷（1+1）溶液定容后用气相色谱-质谱联用仪测试；

4      定量下限、线性范围、回收率和精密度
定量下限（LOD）：参考GB2763-2016的对农药残留的限量要求，若GB2763-2016的限量值小于GB 23200.8-2016方法中的定量限时，实验采用GB2763-2016中最严格的限量值作为定量限。在白菜、苹果、百香果样品（其样品各农残项目均为未检出）中加入1倍的LOD量，按7.2.2进行处理，样液上机测定后，各农残项目的S/N≥10（见2017KX0049号报告），能满足要求，各农残项目的LOD见附表1~3。
线性范围：A组：0~500ng/mL；B组：0~1000ng/mL；C组：0~1500ng/mL；D组：0~2500ng/mL（各农残项目分组组别及线性关系见附表5）
表中样品加标回收率是以白菜、苹果、百香果为样品进行实验的加标回收率，加标水平为1倍的LOD（低水平）、2倍的LOD（中水平）、5倍的LOD（高水平），样品处理按7.2.2及7.2.5步骤进行，回收率数据见附表1~3。
精密度数据见附表4，绝大多数农残项目其RSD符合GB/T 27404-2008的要求（RSD小于15%）。


5      茶叶样品的检测
选取了3个典型性的茶叶样品，这些茶叶样品含有一定量的联苯菊酯、氯氰菊酯、三氯杀螨醇、水胺硫磷、毒死蜱，其结果均满意。

5  仪器和设备
5.1  气相色谱-质谱联用仪，自动进样器，EI源（美国Agilent）
5.2  色谱柱：HP-5MS毛细管柱，30m×0.25mm×0.25μm
5.3  低速离心机
5.4  旋涡混合器
5.5  均质器
5.6  旋转蒸发仪(IKA HB 10 digital )
5.8  氮吹仪：DC-12H型
5.9  C18柱1000mg/6mL（依利特）、Carb/PSA柱500mg/500 mg（安谱）                                                 
5.10  电子分析天平, 感量0.0001g
5.11  电子天平，感量0.01g
6  试剂与溶液
6.1  试剂
6.1.1  丙酮：分析纯、色谱纯
6.1.2  正己烷：分析纯、 色谱纯
6.1.3  乙腈：分析纯、色谱纯
6.1.4  甲苯：分析纯
6.1.5  无水硫酸钠：分析纯，650℃烘4小时备用。
6.1.6  氯化钠：分析纯
6.2  溶液：
溶剂A：丙酮+正己烷（1+1）：取200mL丙酮加200mL正己烷混匀。
溶剂B：乙腈+甲苯（3+1）：取300mL乙腈加100mL甲苯混匀。
6.3  混标标准溶液（55HB（20180104））
各农药残留单标均购自于资质的标物中心研制的标准液。由它们按附表5的要求进行混合配制，稀释所用的溶剂为丙酮。
配制记录见下表。


分组及各组别的浓度见附表5。

附表5  混标标准溶液（55HB（20180104））的浓度及组别

残留目标物	混标母液浓度（ng/mL）	组别	上机各浓度点（ng/mL）
parathion（对硫磷）	500	A组	100、200、300、400、500
isocarbophos（水胺硫磷）	500	A组	100、200、300、400、500
heptachlor（七氯）	500	A组	100、200、300、400、500
beta-cypermethrin（氯氰菊酯）	500	A组	100、200、300、400、500
parathion-methyl（甲基对硫磷）	500	A组	100、200、300、400、500
cyfluthrin 氟氯氰菊酯	500	A组	100、200、300、400、500
isofenphos-methyl (甲基异柳磷)	500	A组	100、200、300、400、500
phorate（甲拌磷）	500	A组	100、200、300、400、500
hexachlorobenzene（六氯苯）	500	A组	100、200、300、400、500
folimat（氧化乐果）氧乐果	1000	B组	200、400、600、800、1000
α-BHC（α-六六六）	1000	B组	200、400、600、800、1000
β-BHC（β-六六六）	1000	B组	200、400、600、800、1000
diazinon（二嗪磷）(二嗪农)	1000	B组	200、400、600、800、1000
chlorpyrifos-methyl（甲基毒死蜱）	1000	B组	200、400、600、800、1000
pirimiphos-methyl（甲基嘧啶磷）	1000	B组	200、400、600、800、1000
fenthion（倍硫磷）	1000	B组	200、400、600、800、1000
chlorpyrifos（毒死蜱）	1000	B组	200、400、600、800、1000
Oxy-chlordane 氧化氯丹	1000	B组	200、400、600、800、1000
quinalphos（喹硫磷）	1000	B组	200、400、600、800、1000
procymidone（腐霉利）	1000	B组	200、400、600、800、1000
γ-chlordane（γ-氯丹）(反-氯丹)	1000	B组	200、400、600、800、1000
PP'-DDE（PP'-滴滴伊）	1000	B组	200、400、600、800、1000
PP'-DDD（PP'-滴滴滴）	1000	B组	200、400、600、800、1000
bifenthrin（联苯菊酯）	1000	B组	200、400、600、800、1000
cyhalothrin（氯氟氰菊酯   三氟氯氰菊酯）	1000	B组	200、400、600、800、1000
pyridaben (哒螨灵哒螨酮)	1000	B组	200、400、600、800、1000
γ-BHC（γ-六六六）林丹	1000	B组	200、400、600、800、1000
PCNB（五氯硝基苯）	1000	B组	200、400、600、800、1000
δ-BHC（δ-六六六）	1000	B组	200、400、600、800、1000
aldrin（艾氏剂）	1000	B组	200、400、600、800、1000
Heptachlor-epoxide 环氧七氯	1000	B组	200、400、600、800、1000
α-chlordane（α-氯丹）顺式氯丹	1000	B组	200、400、600、800、1000
dieldrin（狄氏剂）	1000	B组	200、400、600、800、1000
OP'-DDT（OP'-滴滴涕）	1000	B组	200、400、600、800、1000
PP'-DDT（PP'-滴滴涕）	1000	B组	200、400、600、800、1000
malathion（马拉硫磷）	1000	B组	200、400、600、800、1000
difenoconazole（苯醚甲环唑）	1000	B组	200、400、600、800、1000
deltamethrin（溴氰菊酯）	1000	B组	200、400、600、800、1000
fipronil（氟虫腈）	1000	B组	200、400、600、800、1000
endosulfan sulfate(硫丹硫酸盐)	1000	B组	200、400、600、800、1000
fenitrothion（杀螟硫磷）	1500	C组	300、600、900、1200、1500
dicofol（三氯杀螨醇）	1500	C组	300、600、900、1200、1500
buprofezin（噻嗪酮）	1500	C组	300、600、900、1200、1500
fenpropathrin（甲氰菊酯）	1500	C组	300、600、900、1200、1500
permethrin （氯菊酯）	1500	C组	300、600、900、1200、1500
flucythrinate（氟氰戊菊酯）	1500	C组	300、600、900、1200、1500
thiamethoxam (噻虫嗪)	2500	D组	500、1000、1500、2000、2500
fenvalerate（氰戊菊酯）	2500	D组	500、1000、1500、2000、2500
dichlorvos（敌敌畏）	2500	D组	500、1000、1500、2000、2500
α-endosulfan（α-硫丹）	2500	D组	500、1000、1500、2000、2500
β-endosulfan（β-硫丹）	2500	D组	500、1000、1500、2000、2500
hexythiazox (噻螨酮)	2500	D组	500、1000、1500、2000、2500
methamidophos（甲胺磷）	2500	D组	500、1000、1500、2000、2500
dimethoate（乐果）	2500	D组	500、1000、1500、2000、2500

55种HB-5点校正信息
        化合物            拟合  常量    线性    二次曲线    RSD/Cf
--------------------------------------------------------------------------
  1)    1、甲胺磷          线性  -1.3019 e5  1.3322 e2  -----    0.9478
  2)    2、敌敌畏          线性  -1.2909 e5  2.9867 e2  -----    0.9508
  3)    3、氧乐果          线性  -7.0314 e2  1.1256 e1  -----    0.9831
  4)    4、甲拌磷          线性  -1.3415 e4  2.2691 e2  -----    0.9761
  5)    5、α-666          线性  -8.3306 e4 5.6641 e2  -----    0.9731
  6)    6、六氯苯          线性  -6.8164 e4  3.1810 e3  -----    0.9802
  7)    7、乐果            线性  6.0960 e3  2.4806 e1  -----    0.9678
  8)    8、β-666          线性  -7.7598 e4 4.0851 e2  -----    0.9426
  9)    9、γ-666（林丹）  线性  -6.8833 e4 4.2078 e2  -----    0.9590
10)    10、五氯硝基苯      线性  -9.1949e3  7.7352 e1  -----    0.9823
11)    11、二嗪磷（二嗪... 线性  -4.0712 e4 2.6406 e2  -----    0.9671
12)    12、δ-666        线性  -6.4212 e4  3.4683 e2  -----    0.9596
13)    13、甲基毒死蜱      线性  -1.7597e5  1.0801 e3  -----    0.9642
14)    14、甲基对硫磷      线性    4.5891e2  3.2735 e1  -----    0.9935
15)    15、七氯            线性  -2.9780 e4 5.0677 e2  -----    0.9864
16)    16、杀螟硫磷      线性  -2.5870 e3  2.1199 e1  -----    0.9509
17)    17、甲基嘧啶磷      线性  -2.6138e5  1.4521 e3  -----    0.9605
18)    18、艾氏剂        线性  -6.1808 e4  7.2379 e2  -----    0.9677
19)    19、马拉硫磷      线性  -6.7805 e3  1.0833 e2  -----    0.9804
20)    20、倍硫磷        线性  -1.7294 e4  5.3741 e2  -----    0.9682
21)    21、对硫磷        线性  -9.3245 e3  2.3046 e2  -----    0.9731
22)    22、三氯杀螨醇      线性  -1.7156 e5 6.0226 e2  -----    0.9441
23)    23、毒死蜱        线性  -9.3022 e4  5.5207 e2  -----    0.9722
24)    24、水胺硫磷      线性  -7.1203 e2  1.0438 e1  -----    0.9856
25)    25、噻虫嗪        线性  -1.6520 e3  7.8322    -----    0.9999
26)    26、甲基异柳磷      线性  -3.0839e4  3.6754 e2  -----    0.9572
27)    27、环氧七氯      线性  -1.0195 e5  7.2365 e2  -----    0.9763
28)    28、喹硫磷        线性  -1.2554 e5  6.3612 e2  -----    0.9388
29)    29、氟虫腈        线性  -1.7650e2  1.1555 e1  -----    0.9580
30)    30、腐霉利        线性  -7.6455 e4  4.8684 e2  -----    0.9637
31)    31、反-氯丹        线性  -1.7178 e5 1.3073 e3  -----    0.9828
32)    32、噻螨酮        线性  -7.3426 e4  1.6481 e2  -----    0.9555
33)    33、α-硫丹        线性  -4.9470 e4 1.7068 e2  -----    0.9869
34)    34、α-氯丹        线性  -1.3936 e5 1.1074 e3  -----    0.9848
35)    35、狄氏剂        线性  -7.8976 e3  6.3982 e1  -----    0.9808
36)    36、PP/-DDE        线性  -1.7736 e5 1.7353 e3  -----    0.9530
37)    37、噻嗪酮        线性  -2.2479 e4  9.0667 e1  -----    0.9652
38)    38、β-硫丹        线性  -7.4778 e3 2.1742 e1  -----    0.9681
39)    39、PP/-DDD        线性  -3.5632 e5 1.9692 e3  -----    0.9532
40)    40、OP/-DDT        线性  -4.5413 e5 2.5527 e3  -----    0.9685
41)    41、硫丹硫酸盐      线性  -1.4134e4  6.0780 e1  -----    0.9037
42)    42、PP/-DDT        线性  -1.2246 e5 9.6014 e2  -----    0.9799
43)    43、啶虫脒（吡虫... 线性    3.7050 e2  1.0225    -----    0.9850
44)    44、联苯菊酯      线性  -8.0738 e5  4.8621 e3  -----    0.9550
45)    45、甲氰菊酯      线性  -1.0918 e4  3.1882 e1  -----    0.9235
46)    46、氯氟氰菊酯（... 线性  -5.8071 e3 4.9688 e1  -----    0.9714
47)    47、氯氟氰菊酯（... 线性  -2.8385 e3 3.9392 e1  -----    0.9546
48)    48、氯菊酯-1      线性  -1.9998 e5  8.4560 e2  -----    0.9635
49)    49、氯菊酯-2      线性  -5.7969 e5  2.1015 e3  -----    0.9608
50)    50、哒螨灵（哒螨... 线性  -6.2020 e5 3.0538 e3  -----    0.9512
51)    51、氟氯氰菊酯-1    线性    2.4587e3  2.4677    -----    0.3532
52)    52、氟氯氰菊酯-2    线性    1.0762e3  9.2103    -----    0.9739
53)    53、氟氯氰菊酯-3    线性  -4.2751e2  1.0669 e1  -----    0.9958
54)    54、氟氯氰菊酯-4    线性  -6.0774e2  1.1305 e1  -----    0.9880
55)    55、氯氰菊酯-1    线性  -1.8346 e3  6.9094 e1  -----    0.9847
56)    56、氯氰菊酯-2    线性  -3.1025 e3  6.2861 e1  -----    0.9698
57)    57、氯氰菊酯-3    线性  -3.0786 e3  6.2044 e1  -----    0.9132
58)    58、氯氰菊酯-4      线性  -9.3796 e3 8.4426 e1  -----    0.8967
59)    59、氟氰戊菊酯-1    线性    1.4615e3  1.9529 e1  -----    0.9924
60)    60、氟氰戊菊酯-2    线性    1.5710e3  1.7110 e1  -----    0.9958
61)    61、氰戊菊酯-1    线性  -5.7800 e2  4.7891 e1  -----    0.9686
62)    62、氰戊菊酯-2    线性  -3.5230 e3  3.4226 e1  -----    0.9223
63)    63、苯醚甲环唑-1    线性    6.5646e2  9.7137    -----    0.9966
64)    64、苯醚甲环唑-2    线性    1.6460e3  1.2562 e1  -----    0.9931
65)    65、溴氰菊酯      线性  4.9500 e2  2.2151 e1  -----    0.9961
7  实验方法
7.1  试样制备
参看GB2763-2016附录中的制样要求。
7.2    7.2      前处理步骤
如果所检项目小于50项且不包含水胺硫磷、噻虫嗪、六氯苯时按7.2.1操作。
7.2.1称取植物12.5g（精确至0.01 g）鲜样或1g干样（干扰严重时）于50mL离心管中，干样加入5mL水浸泡半小时，加入20mL乙腈均质30s，加入3g氯化钠再次均质30s，6000r/min离心3min。取上清液10mL。或称取干样2g至50 mL离心管，加入8mL水浸泡半小时，加入20mL乙腈和10g无水硫酸钠，均质30s，再用20mL乙腈清洗均质头，合并提取液6000r/min离心3分钟，上清液经装有10g无水硫酸钠（下面垫一勺的无水硫酸镁）的漏斗脱水于鸡心瓶中，残渣再用20mL乙腈涡旋洗涤，6000r/min离心3分钟，上清液并入鸡心瓶中，再用10mL乙腈冲洗漏斗上的残渣合并洗液40℃浓缩至10mL左右。
净化：方法一：将10mL乙腈提取液移入鸡心瓶中浓缩至剩余2mL左右，待净化。先将剩余2mL左右的乙腈先过经5mL丙酮+正己烷（1+1,V+V）活化的无水硫酸钠（高度约1cm）+Carb/PSA柱（0.5g/0.5g，6mL），用丙酮+正己烷（1+1,V+V）2.5 mL×3次漩涡振荡器洗涤（必要时超声）鸡心瓶，洗涤液继续过Carb/PSA柱，继续用丙酮+正己烷（1+1,V+V）淋洗，收集洗脱液共10mL于接收管中，35℃水浴氮吹至干。用1mL丙酮+正己烷（1+1,V+V）定容，上机测试。
方法二：若样品为含油脂或基质复杂，或检测项目比较多时，应将上述10mL提取液过经10mL乙腈活化的Envi-18柱(1g)，接着再用15mL乙腈洗脱，收集所有洗脱液，旋转蒸发浓缩至剩余2mL左右，以下同方法一。


如果所检项目中含有水胺硫磷、噻虫嗪、六氯苯时则按7.2.2操作。
7.2.2称取植物样品12.5 g（精确至0.01 g）匀浆样品至50 mL离心管中，加入乙腈20 mL，用均质机8000 r/min均质30 s，加入3 g氯化钠，继续均质30 s，旋上盖子充分振荡，6000 r/min离心3 min，用移液管移取上清液10 mL，过Envi-18柱，（经10 mL乙腈溶液活化）再加入15 mL乙腈溶液淋洗，自然流速，收集25 mL洗脱液35℃旋转蒸发至约2 mL，35℃氮吹至约0.5 mL，先加入2 mL乙腈+甲苯（3+1）涡旋，再用2×2.5 mL乙腈+甲苯（3+1）洗鸡心瓶，洗液待过Carb/PSA柱。
将Carb/PSA柱置于另一鸡心瓶上，在柱上装入1 cm高无水硫酸钠，用10 mL乙腈+甲苯（3+1）淋洗，弃去洗液。将样液过柱，用20 mL乙腈+甲苯（3+1）淋洗自然流速，收集25~30 mL洗脱液35℃旋转蒸发至约2 mL，用丙酮2×2.5 mL转移至离心管中35℃吹氮至近干，再加入2 mL丙酮吹氮至干，用1+1=丙酮+正己烷定容至1 mL上机。



7.2.3干样品：2 g样提取2遍（2 g全量提取），然后按相应植物性样品方法操作，该样品需单独配一个加标样进行质控，全程监控。
7.2.4若某些干品按7.2.3处理后干扰严重，则重做一次，取样1 g，加9 g水（1 g提取后分取一半），按相应的方法操作，定量下限×10，该样品需单独配一个加标样进行质控，其加标水平与定量下限的调整倍数一致，全程监控。
7.2.5加标回收
往12.5g植物性样品中加入混合标准溶液（55HB）0.25 mL、0.50mL、1.25mL与样品同时同样处理，相当于各目标物的定量限1倍的LOD、2倍的LOD、5倍的LOD。
7.3 仪器参数与测定条件
载气为氦气（纯度99.999％），恒流模式，流速为1.0 mL/min，进样口温度290 ℃，进样量1 μL，不分流进样，色谱-质谱接口温度280 ℃，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，离子化方式EI，电子能量70 eV。
    柱温程序：60℃（2min）^15℃/min150℃^5℃/min 170℃ ^2℃/min210℃^5℃/min230℃^10℃/min 300℃（3min）
300℃后运行3 min。

8  结果计算
8.1 定性
1、保留时间：样品中未知组分的保留时间与标样在同一色谱柱上的保留时间相比较，如果样品中某组分的两组保留时间与标准中某一农药的两组保留时间相差都在±0.1min内。
2、定性定量离子：样品中未知组分同时含有所有定性定量离子。
3、定性定量离子丰度比：在无干扰的情况下，样品中未知组分含有定性定量离子丰度比偏差不超过±20％。
8.2 定量
样品中被测农药残留量以质量分数w计，数值以毫克每千克（mg/kg）表示，按公式（1）计算：



式中:  w---试样中被测农药的残留量，mg/kg
      C---样液被测农药的浓度，ng/mL
      V---样液最终定容体积，mL
      m---实际取样量，g
    n---提取量V/净化量V

9  分析步骤的关键控制点及说明
若检测项目含有易挥发性目标物（如敌敌畏等），浓缩时一定不能蒸干，留约 2mL乙腈。
方法一没有过ENVI-18柱子，普通的蔬菜（不含油脂如白菜、生菜、花菜等）不过ENVI-18可以达到要求，节省成本。如基质复杂（如辛辣味的、干香菇等）或含油脂样品（如毛豆、花生、玉米等）、或所做项目很多50项以上则按7.2.2操作。ENVI-18柱上不加无水硫酸钠，由于个别项目较难洗脱，采用乙腈继续淋洗，当无法对样品基质做出判断时，一律按方法二进行操作。
过Envi-18柱和Carb/PSA柱时，洗脱速度不能太快，自然流速，柱中的液体不能流干了，否则会导致一些农药回收率偏低。
真空浓缩及氮吹时温度设置为35℃，氮吹时气流不可太大，否则部分农药回收会偏低。
连续进样100针以上，要注意切割柱头（大概8cm以上），若不是连续进样100针以上，一个月切割一次柱头。
甲胺磷、敌敌畏、氧乐果、乐果、乙酰甲胺磷对色谱柱的要求较高，如果走的谱图效果不好，应切割柱头至少20cm以上，如果样品谱图较好，没什么杂峰，信噪比高，可直接出报告，若杂峰较多，则必须将样液使用GC-FPD重新测试，若谱图依然有杂峰，则使用专属性前处理方法重新处理后测试。
菊酯类（特别是氯氰菊酯、氟氯氰菊酯）：没有干扰的情况，几个同分异构体可以进行峰面积加和来定量，如果有干扰的情况，则要视干扰的情况，以没有干扰的那个异构体以峰高或峰面积进行定量，判断是否有干扰，将样品、样品加标、标准溶液以定量离子碎片进行谱图叠加判断。具体情况见附件1。
如果检测的基线较高（大于5000），通常是气相部分要进行维护了，此时应进行进样口的维护、衬管的更换、色谱柱的老化，必要时进行离子源的清洗。
衬管刚更换时，要用高浓度的标液先饱和下衬管的活性点，以保证进样的重复性。
六氯苯：极易挥发，且极性大，要用乙腈+甲苯=3+1洗脱30mL，旋蒸及氮吹时且一定不能至干，方能保证六氯苯的回收率再60%以上，必要时对六氯苯单独采用硫酸磺化法进行净化处理。
在做方法验证时，所用的固相萃取小柱要进行回收率试验，其数据见附件2。
为了避免检测时出现的假阳性，必要时更换成别的离子碎片进行检测，详见附件3。

10  参考标准
GB23200.8-2016 《食品安全国家标准水果和蔬菜中500种农药及相关化学品残留量的测定气相色谱-质谱法》
GB2763-2016  《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》
GB/T5009.146-2008 《植物性食品中有机氯和拟除虫菊酯类农药多种残留量的测定》中气质部分
  NY/T 1379-2007 《蔬菜中334种农药多残留的测定气相色谱质谱法和液相色谱质谱法》中气质部分
GB/T23204-2008《茶叶中519种农药及相关化学品残留量的测定气相色谱-质谱法》