主题:【第十一届原创】包装饮用水中铜绿假单胞菌的检测和鉴定

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鹤壁农检联合队发表于:2018/10/11 20:05:23 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复
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                                                                包装饮用水中铜绿假单胞菌的检测和鉴定

致病性
主要致病物质是内毒素,此外尚有菌毛、荚膜、胞外酶和外毒素等多种致病因子。可引起局部化脓性炎症,也可引起中耳炎、角膜炎、尿道炎、胃肠炎、心内
膜炎 、脓胸,还可引起菌血症、败血症及引起婴儿严重的流行性腹泻。
            国内外污染情况- 参考文献
国内污染情况:
  -瓶装天然矿泉水铜绿假单胞菌的检出率1.2%~23.6%;  -瓶装饮用纯净水铜绿假单胞菌的检出率11.6%。
国外污染情况:
    -Richards等在104件检品中的4件分离到铜绿假单胞菌;    -Rosenberg报告德国1.2%~10.2%的瓶装矿泉水检出铜
    绿假单胞菌。
•  刚出厂的产品中铜绿假单胞菌数量较少,但有文献报  道5加仑桶装产品(1531天的保存期),铜绿假单胞
  菌可生长繁殖达到 10^4 CFU/ml

•  国内卫生标准:0  CFU/250ml

二、实验室检验

          GB 8538-2016  铜绿假单胞菌检测(滤膜法)

原    理
        将250mL水样用孔径为0.45μm的滤膜过滤,并将滤膜移至CN琼脂培养基上,于36℃士1℃恒温箱中培养48h,能够在CN琼脂上生长并产生绿脓菌素,或者能够在CN琼脂上生长并且氧化酶呈阳性、紫外光(360±20nm)照射下能发荧光、能够利用乙酰胺产氨的革兰氏阴性无芽孢杆菌,经证实为铜绿假单胞菌,则其检测结果为阳性。



操作步骤-水样过滤
        在100级的洁净工作台进行过滤操作。首先用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分,将粗糙面向上,贴放在已灭菌的滤床上,固定好滤器,将250mL水样或稀释液通过孔径0.45μm的滤膜过滤,然后将过滤后的滤膜贴在已制备好的CN琼脂平板上,平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着气泡。





可疑菌落计数情况
计数所有显蓝色或绿色(绿脓色素)的菌落,初步判定为铜绿假单胞菌。(需要做绿脓菌素的测定)
计数滤膜上所有发荧光不产绿脓色素疑似铜绿假单胞菌菌落,并进行乙酰胺肉汤确定试验。
(在紫外线下检查滤膜时,应避免长时间在紫外光下照射,否则可能会将平板上的菌落杀灭,而导致无法在证实培养基上生长。)
将其它所有红褐色不发荧光的菌落进行氧化酶试验、乙酰胺肉汤、金氏B培养基确证实验。





纯  化
• 营养琼脂:将需验证的可疑菌落划线接种营养琼脂培养基,于36℃±1℃培养  20h~24h,对可疑菌进行纯化

将最初显红褐色的菌落进行氧化酶试验
氧化酶试验 :
原理:氧化酶(细胞色素氧化酶)是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌,首先使细胞色素C氧化,再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化,生成有色的醌类化合物。
操作:取23滴新鲜配制的氧化酶试剂滴到放于平皿里的洁净滤纸上。用铂金丝接种环或玻璃棒,将适量的纯种培养物涂布在预备好的滤纸上。在10秒内显深蓝紫色的视为阳性反应。也可以按照商品化氧化酶测试产品的说明书进行该项测试。

产氨实验(乙酰胺肉汤
原理:铜绿假单胞菌产生一种脱酰胺酶,可使乙酰胺经脱酰胺作用释放氨,滴加钠氏试剂(碘化汞钾),氨在碱性条件下与碘化汞钾作用,生成红色的络合物。
•操作:将纯培养物接种到装有乙酰胺肉汤的试管中,在36℃±1℃下培养20h~24h。然后向每支试管培养物加入1~2滴钠氏试剂,检查各试管的产氨情况,如表现出从深黄色到砖红色的颜色变化,则为阳性结果,否则为阴性。



产荧光素实验(金氏B培养基)
原理:蛋白胨提供氮源,磷酸盐促进荧光素的产生并抑制绿脓色素的产生,硫酸镁为荧光素的产生提供必须的阳离子,琼脂是培养基的凝固。
操作:将上述呈红褐色的且氧化酶反应呈阳性的培养物接种于金氏B培养基上,于36℃±1℃恒温箱培养24h5d。 每天需取出在紫外灯下检查其是否产生荧光性,将5d内产生荧光的菌落记录为阳性。



计数结果说明
菌落计数公式:
NPF(cF/nF)R(cR/nR)
- P是呈蓝/绿色的菌落数(所有证实为铜绿假单胞菌的菌落)。
- F是没有绿脓色素但显荧光的菌落数。
- R是呈红褐色的菌落数。
- nF是进行产氨测试的显荧光菌落数。
- cF是产氨阳性的显荧光菌落数。
- nR是进行产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试的红褐色菌落数。
- cR是产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试均呈阳性的红褐色菌落数。

样品稀释:  若样品污染严重,建议对样品进行稀  释,如10倍递增稀释:取30ml样液加入  至270ml无菌生理盐水中,混匀,以此类  推,进行系列稀释。
报 告:  结果以 CFU/250ml计。
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分析学习了包装饮用水中铜绿假单胞菌的检测和鉴定技术知识。