主题:【第十一届原创】【仪器故事】使用酶标仪测定淀粉酶抑制率的方法

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huangza
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使用酶标仪测定α-淀粉酶抑制率方法的研究

1.实验原理

    淀粉的消化主要有α-淀粉酶与α-葡萄糖苷酶的参与,α-淀粉酶水解α-1,4-连接键,消化的产物主要有麦芽糖、麦芽三糖、α-糊精,这些物质的进一步消化要在小肠上靠α-葡萄糖苷酶进行,α-葡萄糖苷酶主要包含麦芽-葡糖淀粉酶与蔗糖-异麦芽糖酶,α-葡萄糖苷酶水解的产物是葡萄糖。因此,通过抑制淀粉酶或葡萄糖苷酶的活性,阻碍食物中碳水化合物的水解与消化,减少糖分的吸收,以达到控制体内血糖浓度水平。

    本实验是针对淀粉酶水解淀粉溶液而导致溶液中浑浊度的变化,测定溶液吸光度值的变化,以抑制剂阿卡波糖作为参照标准,抑制淀粉酶的能力以阿卡波糖当量来表达。

2.实验方法与数据处理
    将空白、样品或标准抑制剂Acarbose(阿卡波糖)与α-淀粉酶溶液混合均匀,37℃保温孵育15min,然后再加入淀粉溶液,快速振荡后在660nm迅速开始测定,利用酶标仪配备软件记录吸光度OD,初始吸光度值记为f1,以后每隔一段时间测定一个点,吸光度分别记为f1, f2 …,抑制剂作用下衰减曲线下的积分面积,扣除无抑制剂的空白曲线下面积,得出抑制剂的曲线下净面积(Net AUC)。衰退曲线下面积AUC可以近似看作各梯形面积之和,可以表达为:
AUC=0.5×(f1+f2)×ΔT+0.5×(f2+f3)×ΔT+...+0.5×(fx+fx+1)×ΔT+...+0.5×(fn-1 +fn)×ΔT
=0.5×[2×(f1 +f2 +...+ fn-1 +fn)-f1 -fn]×ΔT
其中fn代表第n个测定点时的吸光度,ΔT为相邻两个测定点之间的时间间隔,因本实验测定方法中ΔT设定为2min,一共有61测定点,因此该公式可以简化为:
AUC=2×(f2+f3+...+f60)+ f1 + f61
以Acarbose当量μmol Acarbose equivalent/g (μmol AE/g)表达。

3.试剂溶液的制备
3.1 磷酸盐缓冲溶液
3.1.1 CaCl2溶液

准确称取CaCl2·2H2O粉末0.25g溶于100 mL ddH2O,即为CaCl2溶液2500mg/L。
3.1.2缓冲溶液工作液
分别称取8.9g  Na2HPO4·2H2O与6.9g  NaH2PO4·H2O于1000 mL容量瓶中,再量取CaCl2溶液20 mL,混合后用ddH2O定容至1000 mL,这样得到0.1M,pH 6.9的缓冲溶液,冰箱下贮存。
3.2 玉米淀粉溶液
玉米淀粉储备液:准确称取约1.0000g大米淀粉,加入50mL缓冲液,磁力搅拌数分钟后置于78℃左右水浴10分钟,于磁力搅拌器中搅拌自然冷却至室温,即为2%的淀粉溶液(20mg/mL);
玉米淀粉工作液:将储备液用缓冲溶液依次分别稀释至1.0-10mg/mL的工作液。
3.3 α-淀粉酶溶液
准确称取α-淀粉酶固体粉末(23U/mg)40mg,用缓冲溶液定容至10 mL,即为4mg /mL的α-淀粉酶储备液,再依次稀释至0.2、0.1、0.05、0.04、0.025 mg /mL的α-淀粉酶工作液。
3.4 Acarbose标准溶液的配制
0.1g  acarbose定容到100 mL磷酸缓冲液中,得到1mg /mL贮备液,然后用磷酸缓冲溶液依次稀释成的工作液0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg /mL。
4.研究步骤

4.1 淀粉溶液的线性范围
    由于本实验是对样品中浑浊度的变化来进行,而对浑浊度的测量不像紫外-可见分光光度计那样有理想的波长以及会出现明显的特征峰,根据文献大多数浑浊度的测量波长在620-700nm之间。为了确定玉米淀粉溶液的线性,我们选择玉米淀粉溶液的浓度在0-10mg/mL,波长选择660、700、800、900、970nm进行比较。
使用玉米淀粉工作液0-10mg/mL,分别在660nm、700nm、800nm、900nm、970nm波长下测定其吸光度,重复测定3次。不同波长下淀粉溶液浓度与其OD值之间的线性关系图如下:


波长/nm

线性相关系数R2

线性斜率

空白OD值

LOD检测限

LOQ定量限

660

0.9910

0.0561

0.038±0.001

0.048

0.159

700

0.9917

0.0534

0.038±0.001

0.052

0.174

800

0.9922

0.0478

0.041±0.002

0.093

0.310

900

0.9923

0.0432

0.051±0.002

0.108

0.361

970

0.9923

0.0404

0.145±0.002

0.138

0.458

从上图及上表中可以知道,玉米淀粉浓度在0-10mg/mL时的线性关系均较好,相关系数均在0.99以上。虽然线性相关系数较低,但在波长660nm下的线性斜率高于其他波长下的线性斜率,且LOD检测限与LOQ定量限均是最小,因此选择波长660nm作为测定波长。

4.2 淀粉酶的活力
    将20μL的缓冲溶液与20μL的不同浓度α-淀粉酶溶液混合均匀,37℃保温孵育15min,然后再加入60μL的2%淀粉溶液,快速振荡后在660nm迅速开始测定其吸光度值。
以不同浓度的淀粉酶浓度0.4、0.2、0.1、0.05、0.04、0.025 mg /mL,底物选择20mg/mL的淀粉溶液进行试验,在660nm下测定其吸光度值的变化曲线。
660nm下其吸光度值的衰退曲线图:


从上图,在660nm波长下,不同淀粉酶浓度使淀粉溶液的吸光度下降,而且淀粉酶浓度越大,吸光度下降的越快。AUC与淀粉酶浓度成负相关关系,随着酶浓度的增大,曲线下面积AUC逐渐减小。

4.3 抑制剂阿卡波糖活力
    采用不同浓度的阿卡波糖浓度0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg /mL分别进行试验(n=3),淀粉溶液的浓度选择20mg/mL,淀粉酶浓度选择0.2mg /mL。
通过试验,各个不同浓度的阿卡波糖抑制曲线图如下:


从上图看出,阿卡波糖浓度 在0.01-0.05 mg /mL之间与其曲线下净面积Net AUC的线性较好,相关系数R2=0.9972。

4.4 线性研究
    以不同浓度的阿卡波糖0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07mg /mL分别进行试验,淀粉溶液的浓度选择20mg/mL,淀粉酶浓度选择0.2mg /mL。
通过试验,各个不同浓度的阿卡波糖抑制曲线图如下:

不同浓度的阿卡波糖与其曲线下净面积Net AUC的线性关系图如下(重复试验7次):


n

1

2

3

4

5

6

7

av

SD

%RSD

R2

0.9909

0.9806

0.9788

0.9942

0.9934

0.991

0.9932

0.9889

0.0064

0.6477

SLOPE

4433.9

4850.1

4500

4219.3

5675.1

4468

5110.9

4751

503.27

10.593

从上表看出,不同浓度的阿卡波糖与其曲线下净面积Net AUC之间的线性相关系数R2在0.9889±0.0064之间,相对标准偏差0.65%;斜率在4751±503.3之间,相对标准偏差10.6%。

4.5 提取溶剂的影响
对提取溶剂(丙酮:乙醇:水的混合溶剂)进行研究,即以提取溶剂代替缓冲溶液进行试验,并与缓冲溶液进行比较。


其中:
BLK——20μL缓冲溶液+20μL淀粉酶+60μL淀粉;
BLK1——20μL提取溶剂+20μL淀粉酶+60μL淀粉;
Emp——40μL缓冲溶液+60μL淀粉;
Emp1——40μL提取溶剂+60μL淀粉。

通过对提取溶剂稀释10、100、1000、10000倍后再进行同样试验(如下图):


从图上看出,通过对提取溶剂稀释10、100、1000、10000倍后试验,基本对测定无影响。

4.6 样品检测

  将样品提取液代替阿卡波糖加入到淀粉酶溶液中,37℃保温孵育15min,然后再加入淀粉溶液,快速振荡后在660nm迅速开始测定。通过计算得出样品中的AE(阿卡波糖当量)。也可以通过比较抑制率IC50,来判断样品中的淀粉酶抑制率强弱。

5.小结
    通过以上对α-淀粉酶抑制率试验方法进行研究,实验表明,该方法适用于样品中α-淀粉酶抑制率的筛选。

注意事项:

1.  标准溶液或者样品与淀粉酶溶液混合后需在37℃保温孵育15min,再加入淀粉溶液;

2.  加入淀粉溶液让后需要快速振荡后在660nm迅速开始测定;

6.参考文献
1. LEE WAH KOH, LIN LING WONG, YING YAN LOO, STEFAN KASAPIS, AND DEJIAN HUANG.  J. Agric. Food Chem. 2010, 58, 148-154
2. ALVIN ENG KIAT LOO AND DEJIAN HUANG.  J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 9805-9810
3. Elena Lo Piparo, Holger Scheib,Nathalie Frei, Gary Williamson, Martin Grigorov, and Chieh Jason Chou. J. Med. Chem. 2008, 51, 3555-3561
4. TOSHIRO MATSUI, TAKASHI TANAKA, SATOMI TAMURA, ASAMI TOSHIMA,KEI TAMAYA,YUJI MIYATA,KAZUNARI TANAKA, AND KIYOSHI MATSUMOTO.  J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 99-105

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2018/10/17 14:58:54 Last edit by huangza 举报
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您好,我用普通的可溶性淀粉10mg/mL用酶标仪(200-999nm)和紫外(200-800nm)都进行全波长扫描,发现其在660nm的吸光度并不高,
另外福州大学的硕士论文也用了该方法测原花青素对酶的抑制率,想不明白这个问题。。。
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原文由 huangza(huangza) 发表:
淀粉是用什么溶的?
淀粉用去离子水溶的,步骤是淀粉先称号炉子煮沸后,冷却定容
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原文由 huangza(huangza) 发表: 用缓冲溶液溶,用磁力搅拌器搅拌后再78℃水浴10min即可
用缓冲液溶了之后发现吸光度的确上来了