主题:【第十一届原创】【仪器故事】昙花一现的NASBA-ECL

浏览 |回复6 电梯直达
栀子花开
结帖率:
100%
关注:0 |粉丝:0
新手级: 新兵
分析者端木精英队发表于:2018/10/24 11:45:18 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复
维权声明:本文为qzxmsy原创作品,本作者与仪器信息网是该作品合法使用者,该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为,我们将追究法律责任。
10月三等奖
年度人气作品票选 4
投票
【仪器故事】昙花一现的NASBA-ECL

1背景
以下内容摘自百度文库(链接地址:https://wenku.baidu.com/view/16614297daef5ef7ba0d3c93.html)
NASBA(Nucleicacidsequence-basedamplification)技术是一项以RNA为模板的快速等温扩增技术,这项技术特别适用于RNA分子的检测。其特点是整个扩增过程在恒温条件下进行,因此不需要特殊(如PCR仪)的控温装置,大大避免了PCR扩增过程中复杂的温度变化。借助NASBA技术平台,开发了世界上第一个成熟而广泛适用的禽流感早期快速诊断系统。此系统包括对禽流感各亚型包括高致病性病毒的特异性检测,为世界上多个国家地区用于禽流感的早期常规筛查和疫情防控,推动了国内外禽流感疫情监控的发展。该技术平台技术以NASBA病毒检测系统为中心,在确保高灵敏度、高准确率的前提下,使检测周期缩短至半天;且无需特殊的昂贵仪器,检测人员无需特殊技能;它是一个速度快、成本低并且实现了全自动检测的诊断系统,更重要的是此高效灵敏的设备适用于资源有限的高感染区,如:条件落后的基层偏远地区。这些地区也往往是疫情爆发的最前沿。该技术的应用显著减少了大面积筛查时的工作量和成本。
由于该技术是恒温扩增,加上标准化的操作步骤,使不同实验室所得实验结果具有很高的可比性。NASBA技术平台的优越性包括:
1.NASBA不会受到抗体存在的影响,能够区分接种疫苗的生物体中目的病毒存在与否。
2.NASBA在禽流感检测中能够区分致病菌株和非致病菌株。
3.对禽流感H5N1病毒的检测,已经充分的证明:NASBA的灵敏度可以与病毒检测“金标准”——病毒分离法相媲美。
4.与NASBA相比,病毒培养方法操作繁琐、实验时间长,操作严格。即使熟练的技术人员至少需要14天的时间完成整个过程。
5.使用NASBA技术,在最适实验条件下15小时能够扩增1012倍,远远高于PCR的109倍的扩增效果。
实验结果显示,NASBA技术比目前商品化的免疫检测试剂盒敏感至少1000倍,比常规PCR方法也敏感许多,与现行的病毒培养的检测方法灵敏度相当。但是病毒培养通常需要至少几天以上的时间才能得到结果,而NASBA技术常规仅需要4-6小时就可以准确地得到结果,便于尽早采取防治措施。英国与联合国兽医参考实验室(VeterinaryLabAgency)合作并验证,采用NASBA技术对来自不同地区、不同时期爆发的禽流感病毒进行检测,结果显示,NASBA-H5、NASBA-H7、NASBA-AIV均可准确无误地检出病毒。NASBA技术操作简便,自动化水平高,可以减少人为造成的误差。而且还是一种高通量方法,可以同时检测50个样本,非常适用于大规模样品的筛查,节省基层使用时的检测成本。NASBA技术的扩增产物为RNA分子,使用者可以根据需要选择不同的检测方法,如电化学发光法和酶联法等。而且,与PCR的产物DNA分子不同,RNA分子不易对实验仪器和环境造成污染,避免了产物交叉污染实验仪器、操作环境导致的假阳性结果。适用于NASBA技术的样品范围很广,除动物组织,血液、体液样本外,还可对环境样本进行监测,如禽类饲养场所、交易场所、运输工具等等,因此为监测和控制禽流感的传播提供了有效的依据和手段。
2动机
2004年国内发生多起高致病性禽流感疫情,给国人的健康及畜牧业的发展带来了严重威胁,不仅家禽发生疫情,同时也有人感染病例。在此情况下,如何快速诊断禽流感疫情摆在面前,经过调研初步定下两套方案:
第一套方案:传统的PCR扩增系统,采购全进口的PCR仪+电泳仪+凝胶成像系统,约需40万元,意向品牌为BIO-RAD,当时系统为较为流行的品牌的配置;如果增加核酸提取系统,约需增加30万元。
第二套方案:新型的NASBA扩增系统,当时有些疾控中心采购了该系统,据说效果不错,整套系统68万元。
两套方案各自其优缺点:
PCR系统灵敏度较低,但试剂采购方面较为灵活,既可以采购商品化的试剂盒,也可以采购各单品种试剂自行配制混合液;同时可利用的检测标准很多,可委托生物工程公司合成引物后开展多个项目的检测,拓展性很好。
NASBA系统灵敏度很高,据业务代表称可以将5~10份样品混合成1份检测,相对来说单个样品的检测成本更低。但只能采购商品化的试剂盒,拓展性不好,可利用的检测标准也只有禽流感一个系列。
两套方案都有支持者,最后老大拍板决定还是购买更先进的NASBA。
3蜜月
2005年设备终于采购到位,到了好几大箱的东西,除了ECL化学发光阅读器外,还有干燥箱、水浴锅、移液器和几个试剂盒。安装时问了工程师才知道,原来干燥箱、移液器都是用于核酸提取的,水浴锅是用于扩增的,ECL化学发光阅读器是用于检测的。操作流程简述如下:
3.1核酸提取
3.1.1原理:样品中加入裂解液使RNA游离,加入硅土进行吸附,然后洗去杂质,最后加入洗脱液将硅土中的RNA洗下。
3.1.2实际操作:
裂解:向0.1mL样品(如拭子上清液)中加入0.9mL裂解液混匀;
吸附:加入0.05mL硅土悬浮液混匀,室温孵育10 min,以12000r/min离心30 s,移去上清;
洗涤:加入1 mL洗涤液混匀,以12000 r/min离心30 s,移去上清;加入1 mL70%乙醇混匀,以12000r/min离心30 s,移去上清;加入1mL70%乙醇混匀,以12000 r/min离心30 s,移去上清;加入1 mL无水乙醇混匀,以12000 r/min离心30 s,移去上清;
干燥:将离心管敞口置于干燥箱内,56℃干燥10min;
洗脱:每管加入0.05 mL洗脱液并混匀,56℃孵育10min;以12000 r/min离心2 min,将上清转移入另一支离心管,即为所提取的核酸。
3.2核酸扩增
3.2.1原理:NASBA体系中含有T7RNA聚合酶、RNaseH、AMV逆转录酶、NTP、dNTP、引物(P1和P2)以及反应缓冲液。NASBA整个反应分为两相:非循环相和循环箱。在非循环相,引物P1与模板RNA退火,AMV逆转录酶催化合成一条cDNA链,形成RNA-DNA杂交分子,RNaseH水解杂交分子上的RNA,留下一条单链DNA。引物P2随后与这条DNA链的5’末端退火,AMV逆转录酶催化合成第二条DNA链。T7RNA聚合酶识别双链DNA中的启动子区,催化DNA转录为RNA,由每一分子可产生100拷贝RNA。新合成的RNA进入循环相,成为反转录的模板。它们首先与引物P2结合,由AMV逆转录酶催化合成一条DNA链,形成RNA-DNA杂交分子,RNaseH水解RNA,留下一条单链DNA,引物P1退火,逆转录酶再催化合成一条新的含有T7RNA聚合酶启动子的DNA片段,T7RNA聚合酶再以此DNA为模板成更多拷贝的RNA,如此循环反复,RNA拷贝数被不断放大。
3.2.2实际操作:
向试管中加入5μL核酸、10μL扩增试剂,于65℃孵育5min;取出于41℃孵育5min;然后加入5μL酶溶液并混合均匀,继续于41℃孵育5min;取出试管稍作离心,继续于41℃孵育90min。
3.3检测及判定
3.3.1原理:扩增产物可利用ECL化学发光技术进行检测。扩增反应完成后,用生物素标记的捕获探针和5’标记有电化学发光剂(TAG)的ECL检测探针与RNA产物共同作用形成复合物,被寡核苷酸饱和的磁珠携带到电极处,低电压作用下钌离子的氧化还原反应可产生光子。然后在TPA作用下,钌离子再生。因为在此过程中产生光信号的强度与吸附于电极的RNA产物正相关,所以用电化学反光检测仪测定620nm处的发光强度可对RNA定量。
3.3.2实际操作:
取(N+2)个5mL聚丙烯试管进行编号,其中1号作参照,2号作试剂空白;
除1号管外,各加入杂交溶液20μL;
2号管加入检测稀释液5μL,其余管各加入扩增产物5μL,封口膜封管,振荡混合;
所有试管于41℃孵育30min;
除1号管外,其余试管各加入分析缓冲液0.3mL;
振荡仪器调试参照液至不透明,然后加IRS 0.25mL至1号管;
将所有试管放入进样器,建立程序开始检测;
判定:测定值/仪器参照液读数≥0.15,判定为阳性;否则判定为阴性。
3.4体会
对于初涉分子生物学的菜鸟,NASBA技术确实比较方便,一是扩增不需要昂贵的设备,只需要2个水浴锅即可;二是检测实现了自动化,只需将反应体系配制完成后,放进进样器,建立程序即可自动检测;三是扩增效率确实比较高,我们曾经在10份样品制成的混样中检出阳性样品,后来对这10份样品进行逐一检测,其中也只有1份样品是阳性的。
4龃龉
使用了一段时间后,也发现了NASBA存在一些问题,诸如:
4.1对环境温度要求非常严格。仪器说明书上写明使用温度为15℃~25℃,一开始以为是推荐值,后来发现这玩意儿在玩真的,室温一旦超过临界值,仪器就报警且停止工作,除非将室温调整到该范围内。从此以后,只要在夏天或冬天开展NASBA检测,我们就必须至少提前数小时将检测室空调打开,否则根本玩不转。
4.2检测速度慢。经测试,NASBA检测一个样品需1.5min,对于检测几个样品来说影响不大,但在大规模筛查时就不一样了。我们有一次检测300份样品,以5:1混样,实际检测60份混样,为了判定参照液是否稳定,特地在最后一份样品后安排了一次测试,结果发现测试值居然只有最开始的60%左右。向厂方提出疑义,答复是NASBA的灵敏度非常高,一般的样品要么测试值非常低(阴性样品),要么测试值非常高(阳性样品),参照液测试值下降不影响最终结果的判定。尽管实际检测也未发现有临界值样品,但心中总是留下一个疙瘩。
4.3软件界面简陋。仪器是2005年购入的,当时Windows XP已发布4年,而随机软件居然还是DOS版本,操作相当不便。
4.4扩展性不强。当时配套的试剂仅有禽流感、蓝耳病等几个病种,远不如PCR试剂丰富,而且检测标准也只有GB/T 19439-2004《H5亚型禽流感病毒NASBA检测方法》及GB/T19440-2004《禽流感病毒NASBA检测方法》,实验室想在NASBA检测项目上通过认证非常困难。
5分手
2007年国内蓝耳病疫情频发,为了摸清本地疫情情况,准备开展一次大规模检测,采样数量500份左右,需要2个检测试剂盒。向区域代理下了订单后,久久等不到试剂,反复沟通打了不下几十个电话才搞清楚,原来NASBA试剂的订购流程如下:客户向区域代理下单——区域代理每周一次向国内总代下单——国内总代向香港工厂下单——香港工厂接单后安排生产——香港工厂进行质量检测合格后将试剂发给客户。一开始我对这个流程还是有些不相信的,不过等了将近两个月接到HK Express的快递后,我才不得不相信这些试剂真是香港直接寄过来的!
众所周知,疫情来了那就如消防队员扑灭火灾一样,实验室必须在接到样品后的第一时间开展检测,但大陆居然没有NASBA试剂的现货,一盒都没有,我求爷爷求奶奶让他们提供一盒应急,居然也没有!他们都是在接到客户订单后,然后通知工厂按订单生产的,前后耗时近两个月!如果真的发生疫情,这台仪器又能起什么作用!
基于NASBA试剂的供应流程之慢,我们只能将这台只用了两年,耗资68万元的NASBA系统束之高阁,另外建立PCR平台开展实验,这也是我从事实验室工作近20年遇到的设备采购中最遗憾的一件事。

最后的几句话:写下此文,我的心情是比较低沉的,初衷并不是想贬低设备,出自国际大品牌的设备自有其优越性,但由于试剂供应的问题,目前在我们行业几乎均是束之高阁,很令人遗憾。希望厂家能改进试剂生产供应流程,增加品种,焕发昔日荣光。最后附上一张该设备的照片,纪念那逝去的十年光阴。
为您推荐
symmacros
结帖率:
100%
关注:0 |粉丝:0
新手级: 新兵
这个设备价格不菲,但系统怎么更新慢呢?
沧海青城
结帖率:
100%
关注:0 |粉丝:0
新手级: 新兵
WUYUWUQIU
结帖率:
100%
关注:0 |粉丝:0
新手级: 新兵
影子
结帖率:
100%
关注:0 |粉丝:0
新手级: 新兵
zyl3367898
结帖率:
100%
关注:0 |粉丝:0
新手级: 新兵
栀子花开
结帖率:
100%
关注:0 |粉丝:0
新手级: 新兵
确实很可惜,但厂家也因此失去了一批优质客户