主题:【第十二届原创】聚(Hemin-co-GMA-co-EDMA)整体柱的制备及其 在蛋白质分离中的应用

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7月二等奖 年度特等奖
摘要:本文通过原位自由基聚合方式,以卟啉铁(Hemin)和甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA作为二元单体,二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)作为交联剂,1,4-丁二醇、聚乙二醇200N,N-二甲基甲酰胺作为致孔剂,偶氮二异丁腈作为引发剂,经一锅法制备了聚(Hemin-co-GMA-co-EDMA)整体柱。并通过扫描电子显微镜、压汞法、氮吸附法对其性能进行了表征。最后,将其作为高效液相色谱的固定相,对多种蛋白质样品进行了分离。结果表明基于卟啉铁的整体柱具有颗粒堆积的多孔结构,通透性好,柱背压低,对蛋白质具有良好的选择性。
关键词:卟啉铁;整体柱;蛋白质;高效液相色谱
1  绪论
1.1 引言

蛋白质是人体的物质基础,某些蛋白质的表达水平的改变与疾病直接相关。这就要求对这些蛋白质进行细致研究,而将其从复杂的生物基质中分离出来是首要任务。
对蛋白质进行分离鉴定通常使用电泳—质谱、液相色谱—质谱联用技术,但这些方法并不能完全满足蛋白质大分子对操作环境和分析方法要求较高的要求,并且费用较高。聚合物整体柱由于具有较大孔径和良好的生物兼容性,其在蛋白质大分子分离中的应用已经展现了特有的优势。此外,聚合物单体种类繁多,且其表面的官能团可以有多种修饰方法,对不同的蛋白质具有不同的选择性,从而实现分离
1.2 聚合物整体柱
整体柱又称连续床层,是一种在色谱柱管内制备的连续床固定相。整体柱比颗粒填充柱的通透性更好,更易于实现快速分离。整体柱分为无机硅胶整体柱、有机聚合物整体柱、有机无机杂化整体柱(一般是基于硅胶的杂化整体柱)。硅胶整体柱和有机无机杂化整体柱具有良好的稳定性和机械强度,通透性好,但溶胶凝胶技术制备周期长,操作复杂,重复性差 。有机聚合物整体柱制备简单、适用pH范围广(pH1-14)。
聚合物整体柱出现在上世纪90年代初,继而在制备和应用中得到发展,至今已成功地用于分离科学,特别是用于分离生物大分子。多种多样的功能单体使整体柱设计变得更容易。
聚合物整体柱适用范围广,已被用于不同的色谱模式,包括反相液相色谱(RPLC)、亲水相互作用色谱(HILIC)、离子交换色谱(IEC)等。多孔聚合物整体柱通常具有球形颗粒堆积结构,其大型通孔之间的聚合微球有利于显著提高聚合物整体柱的通透性,降低涡流扩散项,使其在高流速下能够有效地分离大分子。斯韦克系统地阐述了各种多孔聚合物整体柱的制备技术,例如,2,2,6,6-四甲基-1-哌啶(TEMPO)介导的活性自由基聚合。Kanamori等以二乙烯基苯为单体,合成了具有明确的连续形态,高的比表面积的大孔聚合物整体柱
除了传统的自由基聚合,Hosoya等报道了一种将环氧单体与二胺类开环聚合的高性能有机聚合物整体柱,在毛细管液相色谱上,其对苯的分离塔板高度(H)可以达到小于5μm。值得注意的是,相比链生长聚合(比如自由基聚合反应)产生的球状结构,逐步聚合方式导致整体柱具有完全不同的形态
1.3 聚合物整体柱在生物大分子分离中的应用
生物大分子样品结构复杂、种类繁多,而且需要在比较温和的条件下进行分离分析。而聚合物整体柱制备简单,分离迅速,且更易被后修饰为多种色谱模式的整体柱,对蛋白实际样品中的多种蛋白质有不同的选择性。因此,随着聚合物整体柱的进一步发展,其在大分子复杂生物样品的分离分析中将具有更为广泛的应用
1.4 本文目的
本实验欲制备一种新型液相色谱聚合物整体柱,用于蛋白质样品的分离分析。由于蛋白样品结构复杂,其中各种蛋白含量相差很大,这就要求液相色谱的固定相必须具有良好的选择性。因此,选择对目标蛋白质分子具有特异分子识别功能的材料,将其作为液相色谱固定相将会提高整体柱对蛋白质的选择性
卟啉,是一类由四个吡咯环组成的吡咯衍生物,属于大分子。其母体为卟吩,卟吩被取代后称为卟啉。一定条件下,金属卟啉与某些蛋白质分子之间能够形成超分子,从而对这些蛋白质具有特异分子识别作用。正是由于金属卟啉对这些蛋白质具有特异分子识别作用,本实验以卟啉铁和甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)作为二元单体,制备了一种新型聚合物整体柱。实验结果表明,该柱对蛋白质大分子具有分离能力。
2  实验部分
2.1 仪器与试剂

Agilent 1100型高效液相色谱仪(Agilent,美国);HWS-24电热恒温水浴锅(上海齐欣科学仪器有限公司);UPT- II -5T型优普系列超纯水器(成都超纯科技有限公司);BT25S型分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司);KQ-500DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);S-430扫描型电子显微镜(Hitachi,日本);TriStar II3020型全自动比表面积和孔径分析仪(Micromeritics,美国);AutoPore II9220 V3.04型压汞仪( Micromeritics,美国)。
氯化血红素(卟啉铁,Hemin)(阿拉丁试剂有限公司);二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)(抚顺安信化学有限公司);甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)、偶氮二异丁腈(AIBN)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(天津市科密欧化学试剂有限公司,分析纯);1,4-丁二醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、聚乙二醇200PEG200)(天津市光复精细化工研究所,分析纯);甲醇(上海星可高纯溶剂有限公司,液相色谱纯);实验用水为超纯水,进入高效液相色谱仪的所有流动相及样品均经规格为0.45μm的微孔滤膜过滤。
2.2 聚(Hemin-co-GMA-co-EDMA)整体柱的制备
按照表2-1中所列柱C1-C8的比例,在试管中加入HeminGMAEDMA1,4-丁二醇、PEG200DMFAIBN,超声15min使完全溶解并混匀,通氮气。分别将预聚溶液装入一端封口的不锈钢柱管中(50mm×4.6mmi.d.),然后密封另一端,使其在60反应10小时。反应完成后,将整体柱连接于高效液相色谱系统,以甲醇在线冲洗除去整体柱中的致孔剂和其他未反应物。

通过调整单体、交联剂、致孔剂的比例来考察各因素对整体柱柱压、孔径大小、通透性等的影响,最终得到优化的整体柱。

2.3 色谱条件
为了达到最佳分离效果,调节流动相磷酸盐溶液/水的比例,寻找对混合蛋白质样品具有最佳分离能力的流动相比例。高效液相色谱仪为安捷伦1100系列,整体柱在不锈钢空色谱管柱(50mm×4.6mmi.d)制得。流动相为0.02mol/L磷酸盐溶液(NaH2PO4+Na2HPO4/水,流速为1.0mL/min。柱温为室温,紫外检测波长为280nm
3  结果与讨论
3.1 聚(Hemin-co-GMA-co-EDMA)整体柱制备条件的优化

HeminGMA作为功能单体, EDMA作为交联剂,1,4-丁二醇,PEG200DMF作为致孔剂,AIBN作为引发剂,聚合方式为热引发的原位自由基聚合,制备聚(Hemin-co-GMA-co-EDMA)整体柱。通过改变整体柱各组分的比例,可以得到对蛋白质分离能力较好的整体柱。观察并比较整体柱各组分不同比例下制备的各聚合物整体柱的外观均匀度、贴壁情况、硬度、机械强度等,综合分析,从中获得最为理想的聚合物整体柱。
3.1.1致孔剂比例对聚合物整体柱制备的影响
整体柱的机械强度和渗透性与致孔剂的种类及用量有很大的关系。单体用量一定的条件下,致孔剂的量越多,整体柱的背压越低而渗透性越大。选择致孔剂时,应注意所选致孔剂既要有良好的占位能力,又不至残留于柱体内而不能被冲洗溶剂洗脱出来。HeminDMF中溶解性好,因此DMF被选为制备聚(Hemin-co-GMA-co-EDMA)整体柱的良致孔剂,与1,4丁二醇和PEG200组成致孔剂体系。表2-1中列出了典型的优化比例的过程,其中C1-C4为采用不同比例致孔剂得到的整体柱,增加1,4丁二醇的比例,能够提高整体柱的渗透率。结果表明:柱C2所采用的三元致孔体系比例能够得到同时具有低背压和高渗透率的整体柱。
3.1.2单体与交联剂比例不同对聚合物整体柱制备的影响
制备聚合物整体柱时,若单体与交联剂的用量占聚合物总量比例过大,则聚合物背压升高,导致渗透性下降;反之,则会导致聚合物整体柱渗透性过高,无法达到对样品的分离效果。此外,交联剂的用量比例增大则聚合物交联度增大,将致使制备的聚合物整体柱孔径减小,结构密实,在比表面积增大的同时,却会使柱压增高,通透性下降。表2-1中,柱C5-C8相比较,改变单体与交联剂的比例,结果表明柱C8性能最佳,机械强度适宜,渗透性良好,后续的分析分离实验均用C8号整体柱完成。
3.2 聚(Hemin-co-GMA-co-EDMA)整体柱的表征
用甲醇为流动相在线冲洗聚合物整体柱,以冲去致孔剂和未反应的单体,并以高流速将整体柱从色谱柱管内冲出,放入真空干燥箱内干燥24小时,分别用扫描电镜法、氮吸附法、压汞法对该聚合物整体柱进行表征。

3.2.1聚(Hemin-co-GMA-co-EDMA)整体柱的扫描电镜图

图3-1分别为柱C8放大3,000倍和30,000倍的扫描电镜图。由图可知:整体柱内部为多孔颗粒堆积结构。
3.2.2聚(Hemin-co-GMA-co-EDMA)整体柱的氮吸附-脱附等温线

通过氮吸附法对该聚合物整体柱的孔类型进行分析,结果如图3-2所示。该等温线符合Ⅲ型等温线,在低压区p/p00.1),曲线偏向 X 轴且没有拐点,氮气和柱材料之间的吸附作用很弱,且在中压段不存在回滞环,表明该材料孔结构中几乎不存在微孔和介孔;在相对压力较高时p/p00.9),氮气和柱材料之间的吸附作用很强,吸附量呈较大上升趋势,表明该材料含有大孔结构。
3.2.3聚(Hemin-co-GMA-co-EDMA)整体柱的压汞法分析图

由于该柱材料含大孔结构,故通过压汞法对其大孔结构进行了表征。由图3-3可知,整体柱的孔尺寸分布范围较窄,表明孔结构较均匀。其孔体积、众数孔径、孔隙率分别为1.40mL/g、3497 nm、57.32 %。
3.2.4聚(Hemin-co-GMA-co-EDMA)整体柱的机械稳定性
图3-4为分别以磷酸盐缓冲液(NaH2PO4+Na2HPO4)和水为流动相时柱C8柱背压与流速的关系图。以磷酸盐缓冲液和水为流动相时,其相关系数r值分别为0.99920.9991,表明柱压与流速有良好的线性关系,且高流速下整体柱稳定性依然良好,表明柱材料具有良好的机械稳定性。

3.3 聚(Hemin-co-GMA-co-EDMA) 整体柱的色谱性能考察
3.3.1整体柱对人血浆的色谱分离

人血浆预处理:取新鲜人血,于4℃,4500r/min的条件下离心15min,取上清液冷藏保存,备用。

以整体柱C8HPLC固定相,以0.02mol/L磷酸盐溶液(NaH2PO4+Na2HPO4/水为流动相,流速为1.0mL/min,对人血浆样品进行pH和离子强度梯度洗脱,结果如图3-5所示。表明整体柱C8对人血浆中的蛋白质具有良好的选择性和较高的分离效能。这是由于整体柱中的卟啉铁结构易于与蛋白质之间形成多种作用力,从而达到特异识别。

3.3.2 整体柱对鸡卵清的色谱分离
鸡卵清预处理:取市售的新鲜鸡蛋一枚,取其蛋清液并用磷酸盐缓冲液(50mmol/L,pH7.0)稀释一倍(V/V)。将稀释后的蛋清液混合均匀于4℃,4500r/min的条件下离心15min,取其上清液冷藏保存,备用。
3-6为整体柱C8对鸡卵清的色谱分离图。结果表明,整体柱C8对鸡卵清中的多种蛋白质具有良好选择性。

3.3.3 整体柱对蜗牛酶的色谱分离
蜗牛酶是一种含有20多种酶的混合物,其主要成分有9种。图3-7为整体柱C8对蜗牛酶的色谱分离图。由图可知,整体柱C8对其中的一些酶有良好的选择性。

尽管聚(Hemin-co-GMA-co-EDMA)整体柱C8对三种实际样品中的某些蛋白质有较好的选择性,但色谱峰普遍存在拖尾情况,这可能是由于卟啉铁能够与蛋白质之间形成配位从而造成拖尾。此外,分离后的蛋白质分析和鉴定工作还未完成,后续的研究需要通过色谱-质谱联用技术对蛋白质进行定性分析。
4  结论与展望

本实验引入新的功能单体卟啉铁(Hemin),制备了聚(Hemin-co-GMA-co-EDMA)整体柱,并将其用于蛋白质的分离。该整体柱具有均匀的内部结构,高通透性和良好机械性能。其对蛋白质的色谱分离结果表明:卟啉铁的引入,能够从复杂的生物样品中分离较多数量的蛋白质,表明整体柱对蛋白质具有良好选择性。

生物样品中蛋白质的分离是一项十分复杂的工作,本文中的方法还需要进一步完善分离机理,改善柱选择性,更有待续的蛋白质鉴定工作需要研究。通过本实验中的方法对蛋白质进行分离和后续的鉴定研究工作的完成将为蛋白质组学的分类、分级研究提供重要的数据支持。

参考文献
            Pellati F, Calo S, Benvenuti S. High-performancechromatography analysis of polyacety and polyenes in echinacea pallida by usinga monolithic reversed-phase silica column . J. Chromatogr. A, 2007,1149(5): 56-65.
            Nonaka S, TsunodM, Aoyama C et al. Determinationof  N,N-dimethyl-arginine in rat plasmaand dimethylarginine dimethylaminohydrolase activity in rat kidney using amonolithic silica column . J. Chromatogr. B, 2006, 843(19): 170-174.
            Motokawa  M, Ohira M, Minakuchi  H et al.Performance of octadecylsilylated monolithic silica capillarycolumns of 530μm innerdiameter in HPLC . J. Sep Sci, 2006, 29(9):2471-2477.
            王超然,王彦,高也等.聚(4-乙烯基苯硼酸-季戊四醇三丙烯酸酯)亲和整体柱的制备与应用.分析化学研究报告, 2012, 40(8): 1207-1212.
            李晶, 周琰春,张嘉捷等.阴离子交换聚合物整体柱的制备及其在离子色谱中的应用.分析测试学报, 2012, 31(9):1089-1094.
            张振宾, 欧俊杰, 林辉等.有机-硅胶杂化整体柱的制备及应用研究进展.高等学校化学学报,2013, 34(9): 2011-2019.
            Lv Y, Lin Z, Svec F. Thiol-ene click chemistry: a facile and versatileroute for the functionalization of porous polymer monoliths . Analyst, 2012,137(9): 4114-4118.
            平贵臣, 袁湘林, 张维冰等.整体柱的制备方法及其应用.分析化学, 2001, 29(12): 464-469.
            Lin Z, Huang H, Sun X etal. Monolithic column based on a poly(glycidylmethacrylate-co-4-vinylphenylboronic acid-co-ethylene dimetharylate) copolymerfor capillary liquid chromatography of small molecules and proteins . J.Chromatogr. A, 2012, 1246(13): 90-97.
        Akira N, TakeshiS. Advancein monolithic materials for sample preparation in drug and pharmaceuticalanalysis . TrAC, 2013, 45(9): 182-196.
        Liu J, Wang F, Zhang Z. Reversed phase monolithic column based enzymereactor for protein analysis. Chin. J. Anal. Chem, 2013, 41(1): 10-14.
        Frantisek S, Lv Y. Advances andrecent trends in the field of monolithic columns for chromatography. Anal. Chem,2014, 87(9): 250-273.
        Liu Z, Ou J, LinH. Preparation of monolithic polymercolumnswithhomogeneousstructurevia photoinitiated thiol-yne click polymerization and their application inseparation of small molecules . Anal. Chem, 2014, 86(105): 12334-12340.
        Jin Zhang, Huilin Zou, Qin Qing et al. Effect of chemical oxidation on the structure of singlewalled carbon nanotubes . J. Phy. Chem. B, 2003, 107(16): 3712-3718.
        Ou J, Liu Z, Wang H. Recentdevelopment of hybrid organic-silica monolithic columns in CEC and capillary LC. Electrophoresis, 2015, 36(9): 62-75.
        王玺, 何健, 季一兵.聚甲基丙烯酸酯毛细管整体柱的制备及其性能考察.中国药科大学学报,2012, 67(7): 78-85.
        吕仁江, 丁会敏, 李英杰.丙烯酰胺-β-环糊精毛细管电色谱手性整体柱的制备及应.应用化学,2012, 29(5): 604-607.
        Trojer L, Lubbad S H, Bisjak C et al. Monolithicpoly( p-methylstyrene-co-1,2-bis( p-vinylphenyl)ethane) capillary columns as novel styrene stationary phases for biopolymerseparation . J. Chromatogr. A, 2006, 1117(1): 56-66.
        白立改,牛文敬,杨更亮.聚合物整体柱在生物大分子分离中的应用.色谱,2013, 9(4): 303-309.
        Zuo L, Zou H, Zhang X et al. Chromatographicseparation of proteins on metal immobilized iminodiacetic acid-bound moldedmonolithic rods of macroporous poly(glycidyl methacrylate-co-ethylenedimethacrylate) . J. Chromatogr. A, 2001, 926(2): 255-264.
        郑晖,李秋顺,马耀宏等. 微流控芯片上电色谱聚合物整体柱研究进展.山东科学,2013, 26(1): 16-21.
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