主题:【第十二届原创】离子色谱法同时测定饮料中两种防腐剂和两种甜味剂

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兴山黄选忠
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8月二等奖 年度一等奖

离子色谱法同时测定饮料中两种防腐剂和两种甜味剂

黄选忠 

(湖北兴山县疾病预防控制中心,443711)



摘要 【目的】建立以SH-AC-3型阴离子交换柱为分离柱,离子色谱法测定饮料中山梨酸、苯甲酸、甜蜜素和安赛蜜的新方法。【方法】试验研究离子色谱法测定饮料中山梨酸、苯甲酸、甜蜜素和安赛蜜的色谱条件和可行性,对色谱条件进行选择、优化。【结果】以SH-AC-3型阴离子交换柱为分离柱,以1.5 mmol/LNa2CO3为淋洗液,流量为1.0mL/min,采用等度洗脱的方式成功测定了饮料中山梨酸、苯甲酸、甜蜜素和安赛蜜,山梨酸、苯甲酸和安赛蜜的线性范围均为0~30.0mg/L, 甜蜜素的线性范围分别为0~15.0mg/L和15.0~30.0mg/L, 方法应用于饮料中山梨酸、苯甲酸、甜蜜素和安赛蜜的测定,加标回收率在90%以上,5次平行测定的相对标准偏差(RSD)小于5%(n=5),方法的检出限在3.0mg/L以下。【结论】所拟方法可用于饮料中山梨酸、苯甲酸、甜蜜素和安赛蜜的同时测定。
关键词 离子色谱法,饮料,山梨酸,苯甲酸,甜蜜素,安赛蜜
食品中山梨酸和苯甲酸、甜蜜素、安赛蜜的测定国家标准推荐的方法分别是气相色谱法和高效液相色谱法、衍生气相色谱法和重氮偶合比色法、高效液相色谱法等,其中,气相色谱法在测定山梨酸和苯甲酸时样品需酸化萃取处理,在测定甜蜜素时必需通过衍生化萃取处理,样品前处理步骤都较为繁杂、干扰因素多、条件不易控制,难以保证待测组分全部转化回收,且不能实现多组分同时测定,工作效率低下。而高效液相色谱法虽然具有样品前处理方法简便快速、可多组分同时测定 等优势,但尚存在仪器价格偏贵、运行费用偏高之缺憾使其应用受到限制。同时安赛蜜的测定方法国家标准只推荐了高效液相色谱一种方法,且高效液相色谱仪基层实验室少有配置故难以开展此项检测工作。离子色谱法以其灵敏、快速、试剂消耗少、无环境污染、可多组分同时测定的优势而备受广大分析工作者的青睐,已应用于食品中防腐剂、甜味剂等多种添加剂的同时测定,但这些方法大多使用的是进口色谱柱并采用KOH淋洗液梯度洗脱方式进行测定,而进口色谱柱特别是具有梯度洗脱功能的离子色谱仪的价格普遍偏贵,基层实验室少有配置,因此研究用国产色谱柱和色谱仪同时测定食品中山梨酸、苯甲酸、甜蜜素和安赛蜜等添加剂是一项有意义的工作,本工作研究了用盛翰色谱公司生产的SH-AC-3型阴离子交换柱和CIC-200型色谱仪测定饮料中山梨酸、苯甲酸、甜蜜素和安赛蜜的色谱条件和可行性,结果表明,以1.5 mmol/LNa2CO3溶液作淋洗液,流量为1.0ml/min,用SH-AC-3型阴离子交换柱为分离柱,采用等度洗脱的方式可使山梨酸、苯甲酸、甜蜜素和安赛蜜较好分离,各组分的峰面积与其浓度在一定的范围内具有良好的线性关系(相关系数r>0.9996),且各组分的保留时间在30 min以内,具有分析应用价值。据此,建立了以青岛盛翰色谱公司生产的SH-AC-3型阴离子交换柱为分离柱,以1.5 mmol/LNa2CO3为淋洗液等度洗脱的方式测定饮料中山梨酸、苯甲酸、甜蜜素和安赛蜜的方法,山梨酸、苯甲酸和安赛蜜的线性范围均为0~30.0mg/L,甜蜜素的线性范围分别为0~15.0mg/L和15.0~30.0mg/L,方法应用于饮料等样品中山梨酸、苯甲酸、甜蜜素和安赛蜜的测定,其结果与气相色谱法相吻合,加标回收率分别为:90.6%~98.5%、96.2~98.6%、95.5%~98.8%和96.8%~98.2%,各组分5次平行测定的相对标准偏差(RSD)小于5%(n=5),按样品稀释25倍计方法的检出限分别为2.0、2.5、1.0和1.5 mg/L。
1、试验部分
1.1主要仪器
CIC-200型离子色谱仪(青岛盛翰色谱公司),抑制器:检测器:电导检测器,定量环体积为25μL;分离柱,SH-AC-3型阴离子交换柱(250×4.0mm  i.d,青岛盛翰色谱公司,批号:1602037);保护柱:SH-AC-3型(50×4.0mm  i.d,青岛盛翰色谱公司,批号:1602037)
1.2 仪器工作条件  柱箱温度35℃,电流:50mA。
1.3主要试剂
苯甲酸标准溶液(GBW(E)100006):1.00 mg/mL;山梨酸标准溶液(GBW(E)100007):1.00 mg/mL;环己基氨基磺酸钠(甜蜜素)标准溶液(GBW(E)100173):10.00 mg/mL;乙酰磺胺酸钾(安赛蜜)标准溶液(GBW(E)100171):1.00 mg/mL;临用时用纯水将各种标准溶液稀释成含山梨酸、苯甲酸、甜蜜素和安赛蜜各250.0 mg/L的混合标准应用液;
75 mmol/LNa2CO3淋洗液贮备液,临用时用纯水稀释50倍使用。
试验所用试剂均为AR及以上级,试验用水为超纯水(18.2ΜΩ·cm)。
1.4 试验方法

1.4.1标准曲线的绘制  取0.50、1.0、1.50、2.0、2.50和3.00 mL混合标准液于25mL容量瓶中加纯水至刻度,混匀,配制成含山梨酸、苯甲酸、甜蜜素和安赛蜜均为5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、 30.0mg/L的标准系列,各进样1 mL上机(仪器工作条件为:柱箱温度35℃;电流:50mA;淋洗液:1.5mmol/L Na2CO3溶液;流量:1.0mL/min;量程:1档)测定各成份峰面积(S),以S对浓度绘制工作曲线。



1.4.2样品测定  将样品稀释25倍经0.22μm滤膜过滤后进样1 mL上机(条件同1.4.1)测定各组分峰面积(S),以标准曲线法定量。
2、结果与讨论
2.1 色谱条件的选择和优化
2.1.1色谱柱的选择  以1.5mmol/L Na2CO3溶液为淋洗液、流量1.0mL/min等度洗脱,考察了青岛盛翰色谱公司生产的SH-AC-1型和SH-AC-3型阴离子交换柱对山梨酸、苯甲酸、甜蜜素和安赛蜜的分离效果,结果表明,在此条件下SH-AC-1型柱不能将甜蜜素和山梨酸完全分离,而SH-AC-3型柱可将山梨酸、苯甲酸、甜蜜素和安赛蜜完全分离,故本试验选择SH-AC-3型阴离子交换柱为分离柱。
2.1.2淋洗液的选择  当以4.5mmol/L Na2CO3-4.0 mmol/L NaHCO3溶液为淋洗液、流量1.0mL/min等度洗脱, 考察了SH-AC-3型阴离子交换柱对山梨酸、苯甲酸、甜蜜素和Cl-及NO3-等阴离子的分离效果,结果表明,在此条件下SH-AC-3型柱完全不能将甜蜜素与Cl-、Cl-与山梨酸分开,及苯甲酸与NO3-的分离效果欠佳,不宜以4.5mmol/L Na2CO3-4.0 mmol/LNaHCO3溶液为淋洗液。当以2.0mmol/L Na2CO3溶液为淋洗液时,山梨酸、苯甲酸、甜蜜素和Cl-及NO3-等阴离子均能较好分离。故选择Na2CO3溶液为淋洗液。
2.1.3 Na2CO3溶液浓度的选择  在高效液相色谱法中选择适当的淋洗液是改善分离度(R)的有效方法,为保证山梨酸、苯甲酸、甜蜜素和安赛蜜的有效分离,同时当以Na2CO3作淋洗液时,Cl-的保留时间介于甜蜜素和山梨酸之间且较为接近、NO3-的保留时间与苯甲酸的保留时间比较接近,考虑到样品中可能存在的Cl-对甜蜜素和山梨酸、NO3-对苯甲酸测定的影响,从而进行了Na2CO3淋洗液浓度的选择试验,结果见表1。从表1可见,当Na2CO3浓度在1.0~2.0mmol/L时甜蜜素、山梨酸、苯甲酸的R值(相对后续组分,

表1  Na2CO3浓度对分离度和保留时间的影响(流量1.0 ml/min)


 

组分

 

1.0mmol/L

 

1.5mmol/L

 

2.0mmol/L

保留时间(min)

R

保留时间(min)

R

保留时间(min)

R

甜蜜素

9.248

1.89

7.723

1.59

7.190

1.40

Cl-

10.509

0.92

8.618

0.92

7.968

0.92

山梨酸

11.433

3.11

9.409

2.76

8.680

2.65

苯甲酸

17.404

1.99

14.022

1.85

13.463

1.70

NO3-

20.011

/

15.986

/

14.474

/


下同)分别在1.89~1.40、3.11~2.65、1.99~1.70,基本满足当R大于1.5时两组分完全分离的要求,说明甜蜜素与Cl-、山梨酸与苯甲酸、苯甲酸与NO3-已完全分离,本试验选择1.5mmol/L Na2CO3溶液为淋洗液,该条件下山梨酸、苯甲酸(20 mg/L)、甜蜜素(10 mg/L)与常见阴离子Cl-、NO3-


图1 甜蜜素、Cl-、山梨酸、苯甲酸、NO3-分离效果图



(2 mg/L)分离效果较好,见图1。
2.1.4淋洗液流量的选择  淋洗液流量主要影响组分的保留时间和分离度,本试验淋洗液流量在0.8mL/min~1.2mL/min时甜蜜素、山梨酸、苯甲酸的R分别在1.51~1.68、2.33~3.12和1.74~1.91,各组分都能很好的分离,见表2。偏高的流量虽然可缩短组分的保留时间、分离度R增大但使柱压

表2  淋洗液流量对分离度和保留时间的影响(Na2CO3浓度为1.5mmol/L)


 

组分

 

0.8ml/min

 

1.0ml/min

 

1.2ml/min

保留时间(min)

R

保留时间(min)

R

保留时间(min)

R

甜蜜素

9.900

1.51

7.789

1.59

6.524

1.68

Cl-

10.943

0.95

8.695

0.91

7.345

0.93

山梨酸

12.128

2.33

9.503

2.71

7.940

3.12

苯甲酸

17.913

1.74

14.104

1.86

11.848

1.91

NO3-

20.148

/

16.056

/

13.591

/


也偏大,影响泵的使用寿命,偏低的流量分离时间过长工作效率低,综合考虑淋洗液流量选定为1.0mL/min,此条件下甜蜜素、山梨酸、苯甲酸的保留时间适中,分离效果较好,见图1。
2.1.5柱箱温度的选择  试验了25℃、30℃和35℃各分离效果,结果显示,在25℃时Cl-和山梨酸完全不能分开(只有一个峰)、30℃时Cl-和山梨酸不能完全分开(有两个峰,但二者未完全分开),在35℃时Cl-和山梨酸能完全分离,甜蜜素、山梨酸、苯甲酸和安赛蜜等组分均能较好的分离,其R值均≥1.5,且较低的柱温组分保留时间也延长,从而延长了分析降低了工作效率,为此本试验选择的柱箱温度为35℃。
2.2标准曲线
按照1.4.1配制标准系列,测定各管的峰面积(S),绘制标准曲线,其

表3  标准曲线的回归方程及相关系数


组分

线性范围(mg/L)

回归方程

相关系数(r)

 

甜蜜素

0~15.0

S=231810.50C-190763.33

0.9998

15.0~30.0

S=353022.82C-2052561.70

0.9996

山梨酸

0~30.0

S=11364.00+124843.43C

0.9996

苯甲酸

0~30.0

S=4948.13+110583.93C

0.9998

安赛蜜

0~30.0

S=220305.28C-198874.40

0.9996


标准曲线的线性范围、回归方程、相关系数r列于表3。其中,15mg/L的甜蜜素、山梨酸、苯甲酸和安赛蜜的标准色谱图见图2。


图2 甜蜜素、山梨酸、苯甲酸和安赛蜜标准色谱图



2.3 方法的精密度和检出限
对2种浓度的标准溶液各平行测定5次,计算各成分峰面积的RSD,并按照离子色谱仪检定规程的方法测定仪器30min的基线噪声,以3倍基线噪声除以标准曲线的斜率计算各成分的检出限,甜蜜素、山梨酸、苯甲酸和安赛蜜的检出限分别为0.04、0.08、0.09和0.05 mg/L,若按样品稀释25倍计方法的检出限分别1.0、2.0、2.5和1.5 mg/L,各组分的RSD小于5%(n=5),方法的重复性良好,见表4。

表4 方法的精密度和检出限


 

组分

 

标准液1

 

标准液2

 

检出限(mg/L)

浓度(mg/L)

RSD(%)

浓度(mg/L)

RSD(%)

甜蜜素

10.0

2.98

20.0

2.21

1.0

山梨酸

10.0

4.68

20.0

3.12

2.0

苯甲酸

10.0

3.12

20.0

2.64

2.5

安赛蜜

10.0

3.02

20.0

2.56

1.5


2.4 共存物质的影响
考察了Cl-、NO3-、H2PO4-、SO4-2等4种常见阴离子和乙酸、乳酸、酒石酸、草酸、水杨酸等有机酸对山梨酸、苯甲酸、甜蜜素和安赛蜜测定结果


图3 共存物质色谱法图



的影响,结果表明,乙酸、乳酸的出峰顺序均在待测物之前, 不影响测定;H2PO4-、SO4-2、水杨酸、酒石酸、草酸等的出峰顺序均在待测物之后(SO4-2、水杨酸完全分不开合并为一个峰),对测定结果也无影响见图3,但对于测定可能含有这些成分的样品时应适时延长分离时间,避免对后续样品测定的影响;
2.5 样品测定及回收率试验结果
取可乐、雪碧、果味果乐经超声除去CO2后,用0.01mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至9~10用纯水稀释25倍,用0.22μm滤膜过滤后按1.4.2

表5 样品测定及回收率试验结果

 

组分

 

可乐

 

雪碧

 

果味果乐

平均含量(mg/L)

加入量(mg/L)

回收率(%)

平均含量(mg/L)

加入量(mg/L)

回收率(%)

平均含量(mg/L)

加入量(mg/L)

回收率(%)

山梨酸

<2.0

/

/

14.8*

10.0

90.6

<2.0

20.0

98.5

苯甲酸

6.8*

15.0

96.2

<2.5

/

/

7.2

15.0

98.6

甜蜜素

16.4*

10.0

98.8

18.8

8.0

95.5

<2.0

/

/

安赛蜜

8.4

15.0

98.2

<1.5

/

/

10.4

15.0

96.8



*折算成原液含量分别为0.37、0.17g/L和0.41g/L,气相色谱法结果分别为0.39、0.18g/L和0.40g/L。
方法测定山梨酸、苯甲酸、甜蜜素及安赛蜜的含量并进行加标回收试验,其中山梨酸、苯甲酸、甜蜜素的测定结果与气相色谱法相吻合,加标回收率分别为:90.6%~98.5%、96.2~98.6%、95.5%~98.8%和96.8%~98.2%,结果见表5。
3 小结
本工作建立了以SH-AC-3型阴离子交换柱为分离柱,以1.5 mmol/LNa2CO3为淋洗液等度洗脱的方式测定饮料中山梨酸、苯甲酸、甜蜜素和安赛蜜的新方法,方法选择性及重现性良好,操作简便快速,测定结果准确可靠,适用饮料中山梨酸、苯甲酸、甜蜜素和安赛蜜的同时测定。
参考文献
GB/T 5009.29-2003 食品中苯甲酸、山梨酸的测定 气相色谱法和高效液相色谱法
GB/T 5009.97-2003 食品中环己基氨基磺酸钠的测定 气相色谱法和比色法
GB/T 5009.140-2003 饮料中乙酰磺胺酸钾的测定高效液相色谱法
马国军.离子色谱法测定饮料中7种食品添加剂.理化检验(化学分册),2014,50(6)766-768
罗 亮,姚帮本,吴 巧.高效液相色谱法测定食品中5种防腐剂和甜味剂  .安徽农业科学,2016,44(10):95-97
李静,王雨,梁立娜.离子色谱法同时测定食品中3种甜味剂和2种防腐剂 .食品科学,2011,32(12):239-242
马国军,张玲芳.离子色谱法测定配制酒中甜味剂、防腐剂和阴离子.现代科学仪器,2013,30(4):213-215
许春向,邹学贤.现代卫生化学.北京:人民卫生出版社,2000:492-590
JJG823-2014 中华人民共和国国家计量检定规程 离子色谱仪
(黄选忠,主任技师,兴山县疾病预防控制中心,联系电话:13872688318,E-mail:xscdchxz@sina.com)
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楼主从另一个方面来做这个,不错。但说液相比离子色谱贵,还不普及。。。这不敢苟同。