主题:【第十二届原创】趣谈凝胶渗透色谱GPC/SEC – 检测篇之番外I 之为什么要用光散射检测器

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介绍过传统校正对于相对分子量的检测方法,以及光散射技术对于绝对分子量的检测原理,下面我们通过检测概念、标准样品影响、保留时间影响、对于分布检测的准确性、测试质量判断、对于团聚物的检测以及检测效率几个方面来了解一下GPC技术需要和光散射技术联合使用。
检测概念


光散射法和传统法色谱信号区别
通过RI和光散射检测器连用,凝胶渗透色谱GPC/SEC在一个测试过程中同时收集RI和光散射信号,得到绝对分子量Mw、Mn、Mz,分子量分布,均方旋转半径和第二维利系数。而通过传统校正在一个测试过程中收集RI信号,得到相对分子量Mw、Mn、Mz,分子量分布。
相对分子量的检测的准确性依赖于很多条件,但最关键的一点是溶解在溶剂中的高分子线团的流体力学体积,因为流体力学体积的大小和分布决定了样品的流出时间也就决定了所得到的相对分子量的数值和重复性。

光散射信号和RI信号对于聚苯乙烯及其溴化聚苯乙烯的响应
上面的一个例子中,通过两种不同的检测方法检测了两个样品。一个是聚苯乙烯,另外一个是溴化聚苯乙烯。溴元素是质量很大但是体积很小的元素,溴化的聚苯乙烯和没有溴化的聚苯乙烯相比分子量有明显的升高,但是分子体积基本不变。通过测试我们发现,传统校正下,对于聚苯乙烯和溴化聚苯乙烯的RI信号几乎没有区别,因此传统校正得到的结论是相对分子量没有改变,而通过光散射检测器我们可以看到,溴化之后的散射光强明显加强,说明分子量增大。光散射得到的绝对分子量告诉我们,溴化后的聚苯乙烯分子量是62万,而没有溴化的聚苯乙烯的分子量是25万!
我们再来看一个蛋白质测试的例子。蛋白质样品本身是多肽的四级堆积结构,分子密度较高,而不同聚集态的蛋白团聚物之间的分子密度差别很大,这就导致了相对分子量和其真实分子量之间差别很大。

这个例子中我们首先使用一系列蛋白进行了传统校正曲线的绘制,如上图

利用传统校正曲线检测BSA牛血清白蛋白样品(单体分子量66.4KDa),如上图我们可以看到,其二聚体和三聚体Mw分别得到202KDa和345 Da,这些寡聚体的分子量与其真实值有着明显的偏差。






而通过光散射检测器得到的结果单体66 K Da,二聚体133 K Da,三聚体201 K Da,这与其真实值具有高度的一致性!
标准样品影响


LS = KLS• (dn/dc)^2•M•C
RI = KRI•(dn/dc)•C
通过光散射检测器检测绝对分子量只需要仪器常数KLS和KRI,而仪器常数只取决于流动相的种类、检测温度,不取决于任何标准样品以及标准样品的种类。
而对于传统校正而言,其计算结果严重依赖于标准样品的种类和来源!相对分子量的计算取决于校正曲线,所有影响校正曲线的因素将对于计算结果造成影响,而标准样品是影响校正曲线的重要因素之一。使用不同高分子标准样品由于分子密度的差异,得到不同的标准曲线。即使使用同一种标准样品,相同供应商的不同批次,校正曲线也会有所差异,导致分子量结果不同
保留时间影响




保留时间对于光散射检测和传统检测的意义



通过光散射检测器检测绝对分子量不依赖于样品信号保留时间!分子量结果和重复性只与RI和光散射信号强度相关,与保留时间无关,因而可以得到极高的准确性和重复性。
传统校正严重依赖于样品信号保留时间!由于色谱柱老化,色谱泵不稳定,测试温度波动造成的样品RI信号保留时间的改变会造成分子量结果的明显差异。
对分子量分布的检测准确性

高分子分布信息的准确性取决于分子量检测的准确性。对于窄分布样品如蛋白质,光散射得到的绝对分子量能够正确地表征样品的分布信息。而传统校正由于其分子量是通过校正曲线得到,其分子量在不同的流出时间在校正曲线上有所差别,所以得到的分子量分布与样品的真实结果会有明显偏大。这将影响到检测者得到正确的结论。

典型的蛋白质色谱流出曲线
判断测试质量


绝对分子量分布和相对分子量分布对于信号质量的判断


    通过光散射和RI检测器的结合使用,还可以有效判断GPC的测试质量。在GPC检测过程中如果在错误的制备条件下检测样品,(意味着流动相、色谱柱种类错误),都可能造成高分子样品在色谱柱上的吸附。而高分子在色谱柱上的吸附将会造成GPC在分离过程中高分子材料不按照从大到小的顺序流出,这将导致错误的分子量和分子量分布结果。通过光散射检测器和RI检测结合,可以得知样品在色谱柱上有无吸附,判断依据如下:
[list=disc]


1.绝对分子量是否随着保留时间增加
2. 光散射检测器是否有脱尾,且其回归基线时间是否晚于RI回归基线时间

[list=disc]
如果同时出现以上两种情况,则说明样品在色谱柱上有吸附,需要重新设定检测条件。
传统校正的相对分子量由校正曲线得到,永远随保留时间下降,检测者无法得到样品检测条件是否正确的任何信息!

光散射检测器对于多糖分子的检测。左图测试条件下有吸附,分子量分布具有翘尾,右图条件下没有吸附
上图显示了光散射检测器对于一个纤维素样品测试质量的判断。左图中纤维素样品的光散射信号具有拖尾,同时分子量随流出时间具有向上翘的现象,意味着样品在色谱柱中具有吸附,右图是在正确的色谱条件下检测,分子量随流出时间单相下降。
探测大颗粒或者聚集物

光散射信号对于少量团聚物的存在非常敏感,而RI或者UV检测器完全检测不到


光散射检测器信号正比于分子量的平方,因而对于大分子物质及其敏感,即使是微量存在的大颗粒或者团聚物,也可以得到较强信号。这对于生物领域尤其是蛋白质的研究工作者具有非常重要的意义。而RI检测器只对应于样品的浓度,对于微量存在的团聚物无法检测。

光散射检测器可以检测到BSA团聚物存在,而RI和UV检测器没有信号
检测效率

    通过光散射检测器检测绝对分子量只需要得到仪器常数,无需色谱柱校准。在不更换溶剂的条件下,通常不需要测试标准样品。更换溶剂时需要得到新的仪器常数。而对于传统校正而言,需要经常检测标准样品已确定色谱柱、色谱泵、工作曲线是否正常。而每次标准曲线的测定则需要使用7-13个标准样品,极大地增加了使用者测定样品所需时间。
最后我们通过一个表格归纳不同测试模式的特点

总结:
在这个番外片中,我们聊到了GPC的两种检测方法的区别,以及在GPC中引入静态光散射检测器的意义。正如前几个帖子中所述,没有一种方法是万能的,所有样品都可以检测,光散射也是如此。但是光散射检测器为测试者带来了更多、更准确的信息,为GPC的检测质量提供了良好的依据
好了,先聊到这里,祝大家中秋快乐,团圆安康!
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2019/10/15 15:48:03 Last edit by Insm_f06c4b79 举报
小不董
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感谢分享。
请教一个问题,像文中的BSA样品,RI没信号,LS是有信号的,我们能理解有大分子(团)存在,但能否计算其分子量呢?
小不董
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另文中的有几个地方是图片,还是公式,没显示,老师能否补充?

可以得知样品在色谱柱上有无吸附,判断依据如下:
[list=disc]
1.绝对分子量是否随着保留时间增加
[list=disc]
2. 光散射检测器是否有脱尾,且其回归基线时间是否晚于RI回归基线时间

[list=disc]
如果同时出现以上两种情况,则说明样品在色谱柱上有吸附,需要重新设定检测条件。
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原文由 小不董(doxw0323) 发表:
感谢分享。
请教一个问题,像文中的BSA样品,RI没信号,LS是有信号的,我们能理解有大分子(团)存在,但能否计算其分子量呢?
这种情况是不能计算分子量的,计算分子量需要RI或者UV有信号,提供样品流出组分的浓度信息,谢谢。。。。。。
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原文由 小不董(doxw0323) 发表:
另文中的有几个地方是图片,还是公式,没显示,老师能否补充?

可以得知样品在色谱柱上有无吸附,判断依据如下:
[list=disc]
1.绝对分子量是否随着保留时间增加
[list=disc]
2. 光散射检测器是否有脱尾,且其回归基线时间是否晚于RI回归基线时间

[list=disc]
如果同时出现以上两种情况,则说明样品在色谱柱上有吸附,需要重新设定检测条件。
感谢您细心的阅读,几个地方不是图片也不是公式,是编辑错误,谢谢